真核細胞培養常見問題分析

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本文主要介紹了真核細胞培養時可能遇到的問題,包括可能的原因及對應的解決方案。

1. 細胞培養不貼壁

可能原因

  • 胰蛋白酶消化過度
  • 支原體污染
  • 培養液中無貼壁因子

解決方法

① 縮短胰蛋白酶消化時間或降低胰蛋白酶濃度

② 分離培養物,檢測支原體

③ 清潔支架和培養箱

2. 培養液PH變化過快

可能原因

  • CO2張力不對
  • 培養瓶蓋擰得太緊
  • NaHCO3緩沖系統緩沖力不足
  • 培養液中鹽濃度不正確/li>
  • 細菌、酵母或真菌污染

解決方法

① 按培養液中NaHCO3濃度增加或減少培養箱內CO2濃度,2.0g/L到3.7g/L濃度NaHCO3對應CO2濃度為5%到10%

② 改用不依賴CO2培養液。松開瓶蓋1/4圈

③ 加HEPES緩沖液至10到25mM終濃度

④ 在CO2培養環境中改用基于Earle’s鹽配制的培養液,在大氣培養環境中培養改用Hank’s鹽配制的培養液

⑤ 丟棄培養物或用抗生素除菌

3. 細胞生長緩慢

可能原因

  • 更換了不同培養液或血清
  • 試劑保存不當
  • 培養物中有少量細菌或真菌污染
  • 培養液中一些細胞生長必需成分如谷氨酰胺或生長因子耗盡或缺乏或已被破壞

解決方法

① 比較新培養液與原培養液成分

② 比較新血清與舊血清支持細胞生長實驗

③ 增加起始培養細胞濃度

④ 換入新鮮配制培養液,讓細胞逐漸適應新培養液

⑤ 補加谷氨酰胺或生長因子

⑥ 用無抗生素培養液培養,如發現污染,丟棄

⑦ 用抗生素除菌

4. 細胞培養時死亡

可能原因

  • 培養箱內無CO2
  • 培養箱內溫度波動太大
  • 細胞凍存或復蘇過程中損傷
  • 培養液滲透壓不正確
  • 培養液種有毒代謝產物堆積

解決方法

① 檢測培養箱內CO2

② 檢查培養箱內溫度

③ 取新的保存細胞種

④ 檢測培養液滲透壓

注意:大多數哺乳動物細胞能耐受滲透壓為260–350mOsm/kg。加入額外試劑如HEPES或藥物都有可能影響培養液滲透壓。

5. 黑膠蟲污染

黑膠蟲污染常在培養條件改變、細胞接種密度降低、細胞狀態不佳時顯現,尤其在凍存細胞復蘇時可造成大量細胞死亡。

感染黑膠蟲細胞的表現

  • 細胞培養時生長的旺盛,小黑點會越來越少,反之則多
  • 可以穿透濾膜,也可以通過細胞培養箱空氣進行污染
  • 換掖沖洗后也無多大作用
  • 低倍鏡下觀察為黑色點狀,高倍鏡(400X)下作不規則布朗運動

解決方法

① 體外細胞培養時更換好一點的血清

② 如果是貼壁細胞的話,可用無菌的PBS洗幾次,可一定程度上緩解。若是懸浮的話,可以向其中少加一點滋養細胞(從小鼠腹腔內取的巨噬細胞),加滋養細胞對有黑膠蟲的剛復蘇的細胞很有一定作用

③ 在換液前先加入生理鹽水并輕輕拍打,沖洗干凈后再加入細胞培養液,堅持天天洗,細胞傳代時加生理鹽水再離心一次,稍微加大接種密度,一段時間后,黑膠蟲數目會顯著減少

④ 環丙沙星+哌拉西林,各10ug/ml,選擇片劑,1.5一盒/6片,每片含環丙沙星0.25g,磨成粉,PBS溶解,稀釋到適當濃度,過濾,4度保存。哌拉西林用的注射粉劑,2.5g/瓶,溶解到相應濃度,加入PBS和培養基中,可以觀察到黑膠蟲數量明顯減少

6. 支原體污染

支原體污染表現

  • 細胞形態改變,一般是有梭形變成圓形,不再貼壁生長,漂浮
  • 光鏡下,可以看到細胞膜上吸附很多圓點,40*16倍下約有0.1mm,分布多集中于細胞核周圍和細胞邊緣,中間部位較少
  • 消化時可以看到圓點從細胞膜上游離出來,很多,還會動
  • 細胞培養液變堿,有大量小黑點游離

解決方法

① 添加抗支原體劑量的pbs或者其他平衡鹽液進行潤洗,然后消化

② 常規離心,用添加抗支原體(沙星類較為有效)的完全培養液重懸,植入新的培養瓶

③ 培養并且密切觀察(抗支原體推薦使用的濃度及時間如下)

恩諾沙星 25μ/ml,治療時間一周

環丙沙星10μ/ml,治療時間兩周

司氟沙星10μ/ml,治療時間一周

治療時間滿后撤藥換用普通雙抗培養基或者無抗培養基,另外特別說明因為以上藥物均抗G+-,所以添加的時候不需要再添加常規雙抗

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