酵母雙雜交系統

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酵母雙雜交系統,又稱蛋白阱捕獲系統,是由Fields和 Song等人根據真核轉錄調控的特點創建的。利用酵母雙雜交系統能夠快速、直接分析已知蛋白之間的相互作用,并能尋找、分離與已知蛋白相互作用的配體,在研究抗原和抗體相互作用、發現新的蛋白質和發現蛋白質的新功能、篩選藥物作用位點及藥物對蛋白互作影響、建立基因組蛋白連鎖圖等方面應用廣泛。

酵母雙雜交原理

酵母雙雜交系統的建立是基于對真核生物轉錄調控過程的認識。真核生物中基因轉錄需要轉錄激活因子的參與,真核生物的轉錄激活因子含有兩個不同的結構域:DNA結合結構域(DNA binding domain,DNA-BD)和DNA轉錄激活結構域(Activation domain,AD),這兩個結構域可以獨立分開,功能互不影響。BD和AD分別單獨作用并不能激活轉錄反應,只有當二者在空間上充分接近時,才呈現完整的轉錄激活因子活性,使下游基因得到轉錄。根據這一原理,可設計酵母雙雜交系統。

將兩待研究蛋白(蛋白X與蛋白Y)分別與BD、AD結構域構建融合質粒。將構建好的兩個質粒轉入同一酵母細胞中表達,如果兩蛋白之間不存在相互作用,則下游基因(報告基因)不會轉錄表達;如果兩個蛋白存在相互作用,則BD與AD兩結構域空間上很接近,從而下游基因(報告基因)得到轉錄。判斷通過報告基因表達與否,即可判斷兩蛋白之間是否存在相互作用。

酵母雙雜交技術原理

圖1:酵母雙雜交原理

如何判斷是否存在相互作用?

報告基因作為一種營養標記,常用的有HIS3,URA3,LacZ和ADE2等,對應的宿主菌則是相應標記的缺陷型細胞,必須要在含有該營養標記的培養基中生長。因此,當有相互作用的蛋白存在時,激活報告基因的表達,從而能夠在不含營養標記的培養基中生長,以此驗證是否存在相互作用。

酵母雙雜交系統重要元件

酵母雙雜交系統由三個部分組成:

  • 與DNA結合結構域(BD)融合的蛋白表達載體(BD-X),被表達的蛋白稱為誘餌蛋白(bait)或稱為誘餌,通常誘餌蛋白為已知蛋白。
  • 與轉錄激活結構域(AD)融合的蛋白表達載體(AD-Y),被其表達的蛋白稱為靶蛋白(prey)或稱為獵物,靶蛋白可以為cDNA文庫、基因片段或基因突變體等。
  • 帶有一個或多個報告基因的宿主菌株。常用的報告基因有HIS3,URA3,LacZ和ADE2等,而菌株則需具有相應的缺陷型(如果報告基因為HIS3,則菌株應為HIS3的缺陷型。雙雜交質粒上帶有特定的抗性基因和營養標記),一個菌株可以含有1個、2個或多個報告基因。

目前酵母雙雜交實驗采用的系統有LexA系統和Gal4系統兩種。在LexA系統中,DNA結合結構域由一個完整的原核蛋白LexA構成,轉錄激活結構域則由一個88個氨基酸的酸性的大腸桿菌多肽B42構成,它在酵母中可以活化基因的轉錄;在Gal4系統中,BD和AD分別由Gal4蛋白上兩個不同的結構域(1-147aa與768-881aa)構成。

酵母雙雜交技術

為什么選擇酵母作為雙雜交系統的報道株?

酵母作為酵母雙雜交系統的報道株,它具有諸多優點:易于轉化、回收擴增質粒;具有可直接進行選擇的標記基因和特征性報道基因;酵母內源性蛋白不易同來源于哺乳動物的蛋白結合。

酵母雙雜交系統應用

  • 檢驗一對已知蛋白間的相互作用;
  • 用已知功能的蛋白基因篩選雙雜交cDNA文庫,以研究蛋白質之間相互作用的傳遞途徑;
  • 通過對待測蛋白做點突變或缺失突變處理,研究一對蛋白間發生相互作用所必需的結構域;
  • 分析新基因的生物學功能。即以功能未知的新基因去篩選文庫,然后根據釣到的已知基因的功能推測該新基因的功能。

酵母雙雜交系統優勢

利用酵母雙雜交系統可以直接、快速的研究蛋白-蛋白之間的相互作用,具有敏感性高、操作簡便等優點

  • 敏感性高:檢測結果是基因表達產物的積累效應,如酵母的表型,因而可檢測存在于蛋白之間微弱或暫時的相互作用
  • 操作簡便:與其它檢測方法相比,酵母雙雜交實驗不需要進行蛋白純化,省去了純化蛋白質的繁瑣步驟
  • 真實性好:相互作用的驗證在細胞內進行,能真實的反應蛋白間的相互作用
酵母雙雜交系統 免疫共沉淀(Co-IP)
檢測瞬時相互作用
檢測弱相互作用
驗證方式 體內相互作用檢測 體內相互作用檢測
是否需要蛋白純化
是否需要抗體

表1:酵母雙雜交與免疫共沉淀對比

酵母雙雜交系統局限性

假陽性

假陽性是酵母雙雜交實驗常遇到的問題,假陽性是指兩待測蛋白沒有相互作用但依然顯示出了陽性結果。產生假陽性的原因很多,如某些蛋白質本身具有激活轉錄功能或在酵母內表達時發揮轉錄激活作用,使DNA結合結構域雜交蛋白(BD-bait)在無特異激活結構域的情況下可激活轉錄。另外有些蛋白質表面有對其它蛋白質的低親和力區,容易形成蛋白體復合物,能夠引起報告基因表達,產生假陽性結果。

為了降低假陽性需要設計正確的對照,應對誘餌蛋白和靶蛋白能否單獨激活報告基因做驗證。使用兩個或兩個以上的報告基因也可以降低假陽性,利用兩個以上報告基因,只有同時具有兩種以上相應表型才是真陽性結果。另外, 將報告基因整合到染色體上,可以使基因表達水平穩定,消除了由于質粒拷貝數變化引起基因表達水平波動而造成的假陽性。

不能檢測某些在核外蛋白之間的相互作用

酵母雙雜交分析相互作用的蛋白必須定于核內才能激活報告基因,但是很多蛋白質的相互作用依賴于翻譯后加工,如二硫鍵的形成等,而此過程需要在包漿內完成,這樣有多種蛋白質不適用此方法。
為了解決這一問題,人們對酵母雙雜交技術進行改進,發展了核外雙雜交技術(見下文)。

酵母雙擇交技術的新發展

在傳統酵母雙雜交系統的基礎上,發展了多種改型的雙雜交技術以適應不同目的需要。

反向雙雜交技術

反向雜交技術(也成反式雙雜交技術)主要用于在確定蛋白質之間相互作用后,進一步研究其結構和功能的關系,確定蛋白質間作用的關鍵位點或起決定作用的個別氨基酸、特定結構等。這項技術的特點是采取了反選擇篩選策略,其關鍵是報道基因的表達產物對細胞生長有抑制作用。這樣當誘餌蛋白與靶蛋白存在相互作用時,表達出有毒性的報道蛋白,細胞不能生長。

例如Vidal等采用了反式選擇性的報告基因URA3,其編碼的酶使細胞不能在5一氟乳清酸存在的情況下下生長。如果融合蛋白的相互作用被阻斷, URA3則不表達,酵母菌表現對5一氟乳清酸的抗性。因此,采用反式雙雜交系統可以很容易地檢驗出與某一蛋白相互作用的蛋白的突變體。對突變體進行研究,即可找出影響蛋白質間相互作用的關鍵位點。

酵母三雜交系統

酵母三雜交系統

酵母三雜交系統可以用于檢測蛋白質-核酸之間的相互作用。三雜交系統的本質與雙雜交是相同的,只是需通過第三個分子的介導把兩個雜交蛋白帶到一起。它的基本原理是將一個已知與RNA結合的蛋白與BD構建第一個融合蛋白,將待測蛋白質與AD構建第二個融合蛋白,同時構建一條含有兩個不同結合位點的融合RNA,當RNA與兩個融合蛋白相結合時,可激活報道基因的表達。除了蛋白質-核酸之間的相互作用,酵母三雜交系統也可用于檢測檢測蛋白質與肽配體、蛋白質與有機小配體、蛋白質與蛋白激酶間的相互作用。

核外雙雜交技術

在傳統的酵母雙雜交系統中,蛋白之間的相互作用是在細胞核內發生的。因此,它不能檢測某些在核外蛋白之間的相互作用。為了克服這種局限性,發展出了核外雙雜交技術。該技術以SRS 和 USPS兩種系統為代表。

SRS 也稱 Sos 蛋白召集系統 (Sos RecruitmentSystem) 。它的基本原理是分別將待測蛋白X與哺乳動物細胞的一種鳥苷交換因子( EGF) Sos蛋白融合;將Y蛋白與錨定在酵母細胞膜上的Src肉豆寇烯化信號蛋白融合 ,并使它們共表達于一個cdc25-2基因溫度敏感型突變的酵母菌株內。由于該菌株中cdc25-2基因編碼的 EGF 蛋白在 36 ℃條件下不能激活細胞膜上的Ras蛋白,Ras途徑不通。所以細胞無法在36 ℃條件下生存。但如果待測蛋白X與Y之間發生相互作用就能把Sos蛋白帶到細胞膜上并激活附近的Ras蛋白,從而打通Ras途徑,使該菌株獲得在36℃條件下生存的能力。

USPS也稱為基于遍在蛋白的裂解蛋白感受器。它的設計是根據這樣一個事實,即真核細胞中遍在蛋白與某一蛋白之間新生成的融合會被遍在蛋白特異的蛋白酶(UBPs) 迅速切開,但這種切割只有當遍在蛋白正確折疊時才會發生。研究發現,遍在蛋白基因的N端和C端這兩部分即使分離,只要共表達與同一個細胞內,它們仍能正確折疊。將待測蛋白X與帶有點突變的遍在蛋白N端片段融合,將待測蛋白Y與下游接有報告蛋白的正常遍在蛋白C端片段融合,并使它們共表達與同一個細胞內。因遍在蛋白N端片段內含有點突變,它與C端片段之間不能自然形成正確的折疊。只有當蛋白X和Y之間發生相互作用時才能克服點突變的影響,使遍在蛋白的兩端形成正確折疊,從而引來UBPs切除與C端片段連接的報告蛋白。此技術建立之初是通過Western blot檢測有無被切下的報告蛋白來判斷待測蛋白之間是否發生了相互作用的,所以操作比較繁瑣,不便于推廣。最近有人對它作了改進 ,以一種融合的轉錄激活因子PLV作為報告蛋白。PLV一旦被從遍在蛋白C端片段上切下,它就會進入細胞核內激活特定的報告基因 ,如LacZ和HIS3等。這樣就可以根據轉化細胞是否生長及顯色來判斷待測蛋白之間有無相互作用。因此極大地簡化了操作步驟,提高了篩選效率。

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