降落PCR

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盡管目前PCR技術已相當普遍和成熟,但由于PCR反應中許多條件(如Mg2+、dNTPs、引物、模板、循環中的參數等)仍然會影響實驗結果,特別對于一些復雜的基因組DNA模板,普通PCR往往存在非特異性擴增,得不到理想的產物。為了解決PCR非特異性擴增的問題,Don等人于1991年發明了降落PCR(touchdown PCR,TD-PCR)技術。

技術原理

降落PCR是通過對反應體系中退火溫度進行優化來提高反應的特異性,其基本原理為:根據引物的Tm值,設置一系列從高到低的退火溫度,開始選擇的退火溫度高于估計的Tm值,每一個(或n個)循環降低1℃(或n℃)退火溫度,隨著循環的進行,退火溫度逐漸降低至Tm值,最終低于Tm值達到一個較低的退火溫度。最后以此退火溫度進行10個左右的循環。

PCR反應中退火溫度會對擴增結果產生影響,隨著退火溫度的升高,擴增特異性會變好,同時擴增效率會變低。退火溫度過高會使PCR效率過低,退火溫度過低則會使非特異性擴增過多。降落PCR一開始先用高溫擴增,保證擴增的嚴謹性(在較高的退火溫度下通常得到特異性擴增產物),待目的基因的豐度上升后,降低擴增的溫度,提高擴增的效率。當退火溫度降到非特異擴增發生的水平時,特異產物會有一個幾何級數的起始優勢,在剩余反應中非特異的位點由于豐度低無法和特異位點競爭,從而產生單一的占主導地位的擴增產物。

降落PCR具有以下三個特點:

  • 低水平、高特異性的擴增在循環的早期開始,此時的退火溫度高于“最合適”的退火溫度;
  • 當退火溫度在目的產物的Tm值與假陽性產物的Tm值之間時,目的產物的競爭優勢更加明顯;
  • 較低的退火溫度能很有效地增加目的產物的產量,同時使非特異性的擴增降到最低,因為特異序列在較高退火溫度時得到擴增,等退火溫度降到較低時,已積累大量的特異產物,減少了特異引物與非特異序列結合的機會。

退火溫度設置

通常降落PCR的退火溫度范圍可跨越15℃,從高于Tm值幾度到低于其10℃左右,在每個溫度上循環1~2個周期,然后在較低的退火溫度上循環10個周期左右。

降落PCR的改進

人們為了簡化實驗流程,同時避免最低退火溫度過低會有非特異性產物出現的可能性,將TD-PCR退火溫度縮短至10個系列溫度,此擴增方法稱作MTD-PCR。后來人們又將MTD-PCR再次改進,將退火溫度縮短至5甚至4個溫度范圍,并將這種方法稱為SMTD-PCR。改良后的TD-PCR在每一個停留的退火溫度上循環4或者5次,最后一個退火溫度循環次數增加至20~30個循環,以最大可能提高其特異產物與非特異產物的比率。但改良后的TD-PCR需要從較低的退火溫度開始降落,因為盡管Taq等酶耐熱,但經過太長時間的高溫后其活性也會下降,會由于DNA聚合酶活性喪失過多而得不到足量的PCR產物。

注意事項

  • 由于降落PCR在較早的循環中需避免低Tm值配對,在降落PCR中最好應用熱啟動技術。
  • 降落PCR雖然有一定的優勢,但它并非萬能,降落PCR只能做到“錦上添花”,即能看見主帶,但是存在雜帶,可以利用降落PCR進行優化,但是如果連主帶也看不見,只有雜帶,那么用了降落PCR也不會有很好的效果。

如果擴增后跑膠觀察到許多產物帶或高分子量成片產物,可采取以下措施:

  • 提高DT-PCR的最高退火溫度和最低退火溫度,使其范圍上移;
  • 減少最低退火溫度條件的循環次數;
  • 使各退火溫度下的循環數增加一個,如三個循環降低1℃;
  • 用嵌套式引物重新擴增第一次PCR產物的稀釋物(巢式PCR);
  • 放棄此套引物,重新設計引物擴增;

降落PCR與溫度梯度PCR比較

降落PCR與溫度梯度PCR都是對反應體系中的退火溫度進行優化,但兩者在原理上有所不同。

溫度梯度PCR是指在退火溫度不太明確時,為了找到最優退火溫度,在一臺PCR儀上同時做多管PCR,每一管放在儀器內不同列(有的是不同行)上,分別進行PCR(如50-60℃可以分6管,分別50℃,52℃,54℃,56℃,58℃,60℃),最終找到最合適的退火溫度,并進一步以此退火溫度進行普通PCR擴增。

降落PCR是為了提高反應的特異性,通過設計一系列不斷降低的退火溫度,在同一PCR管內進行PCR擴增,最終獲得大量的特異性擴增產物。

與溫度梯度PCR相比,降落PCR更有優勢,因為采用梯度PCR選擇合適的退火溫度時需要多次反應或多管反應,并且即使通過多次試驗找到最佳的退火溫度后,在更換其它的PCR儀進行同樣的擴增時最適的退火溫度也有可能發生改變,需要重新進行最佳溫度的摸索。而降落PCR只需一次反應就可以獲得很好的擴增效果,避免了對每對引物進行最佳復性溫度的優化和測定工作,并且降落PCR在很大程度上削弱了儀器性能對擴增效果的制約。

降落PCR應用

降落PCR適用于經常更換引物的實驗,在不知道Tm值,同時不想很麻煩的找出最佳Tm值的情況下,使用降落PCR可以快速、特異的得到目的擴增片段。現在很多PCR儀具有設置降落PCR的程序,降落PCR在研究領域中已得到了廣泛的應用。根據各種不同工作的需要,降落PCR還可與其它PCR方法同時使用,如實時定量降落PCR、競爭降落PCR等,這些聯合PCR的反應體系,所需材料均與實時定量PCR和競爭定量PCR相同,所不同的是在PCR的循環過程中使用退火溫度漸低的降落PCR方法,檢測PCR產物的方法與硬件也均同于實時定量PCR和競爭定量PCR。

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