串聯親和純化技術

下載

蛋白質相互作用的研究是闡釋基因功能的重要手段,近年來發展起來的高分辨率質譜技術為蛋白質復合體的鑒定提供了強有力的工具,因此確定蛋白質間相互作用的限制因素不是蛋白質鑒定,而是蛋白質復合體的純化。傳統的純化方法(如親和層析免疫共沉淀)難以得到接近天然狀態的蛋白復合體,且實驗結果可能存在假陽性。

串聯親和純化(tandem affinity purification,TAP)是一種能快速研究體內蛋白相互作用的技術,經過兩步特異性親和純化,可快速得到生理條件下與靶蛋白質存在真實相互作用的蛋白質。TAP方法最初用于酵母中,因其具有通用性、高效性、高純度及假陽性低等特點得到了快速發展,至今已成功運用于許多其他生物(哺乳動物、植物等)相互作用的研究。

產生背景

強大、靈敏度高的高通量質譜(MS) 技術的出現,可以在飛摩爾(fm)以下的范圍檢測肽分子,常用來鑒定相互作用的蛋白質復合體或復合體亞基,大大促進了細胞蛋白質組的生物化學純化方法的發展。但通常難以獲得足夠量純化的蛋白質復合體,成為質譜在這方面應用的一個限速步驟。1999年Rigaut 等共同提出了一套分離復合蛋白的新方法–串聯親和純化(Tandem affinity purification,TAP), 兼具標準親和純化和免疫共沉淀兩種生化方法的優點,為蛋白質復合體的分離鑒定提供了一條新途徑,串聯親和純化聯合蛋白質質譜(MS) 鑒定技術可以進行生物化學純化,雙分子和大分子蛋白質復合體的分析

串聯親和純化原理

利用串聯親和純化檢測蛋白質間相互作用的原理是在靶蛋白質一端嵌入一個特殊的蛋白標簽(TAP tag),不破壞靶蛋白質調控序列。將構建好的靶蛋白質粒轉入靶細胞內進行表達,如果靶細胞內存在相互作用蛋白,則會與靶蛋白結合形成蛋白復合物。利用TAP標簽進行兩步連續的親和純化獲得接近天然條件的靶蛋白復合物。隨后用質譜等技術對靶蛋白復合物進行鑒定,從而達到研究蛋白質間相互作用的目的。

串聯親和純化TAP標簽

最初設計的TAP標簽主要由金黃色葡萄球菌蛋白A的兩個IgG結合域(ProtA)和一個鈣調蛋白結合肽(calmodulin-binding peptide,CBP))構成,中間被一個TEV蛋白酶的酶切位點隔開(見右圖)。

第一輪親和純化

用IgG親和柱進行親和純化,ProtA與親和柱緊密結合,洗去未結合的雜蛋白。再用TEV蛋白酶酶切,獲得CBP-融合蛋白。

第二輪親和純化

將酶切后獲得的CBP-融合蛋白與偶聯有鈣調蛋白的親和柱混合進行第二輪親和純化。在鈣離子存在下,CBP就會與鈣調蛋白緊密結合,用含有EGTA的洗脫液進行溫和洗脫,即可得到高純度的靶蛋白(如果靶細胞內存在相互作用蛋白,則獲會得靶蛋白復合物)。

兩輪的親和純化順序為先利用IgG親和柱進行純化,再利用鈣調蛋白偶聯親和柱進行純化。如果純化的順序互換,可能存在TEV酶污染的問題。

串聯親和純化技術原理

圖2:串聯親和純化(TAP)原理

TAP檢測相互作用實驗流程

  1. 得到穩定表達的細胞或組織
  2. 構建TAP標簽-蛋白質粒導入到細胞或生物體內。獲得可正常表達的融合TAP標簽蛋白。

  3. 細胞抽提物的獲得
  4. 轉染后,獲得細胞抽提物。需要注意的是:各無論何種抽提策略,都必須保證能夠降低非特異性相互作用的干擾,同時盡可能不要破壞自然存在的相互作用。

  5. 串聯親和純化
    • IgG親和柱進行第一輪純化,ProtA與親和柱緊密結合,洗去雜蛋白;
    • TEV蛋白酶酶切,獲得CBP-融合蛋白/CBP-融合蛋白復合物;
    • 鈣調蛋白親和柱進行第二輪親和純化。獲得CBP-融合蛋白復合物。

  6. 質譜檢測

TAP技術優點

  • 可以在細胞生理狀態或者接近生理狀態下,真實地反映蛋白質在生物體內的行為;
  • 經過兩次洗脫,降低了非特異蛋白量,更少的假陽性;
  • 適用于大規模的蛋白質相互作用研究;
  • 可以反應復雜的蛋白相關性,除了鑒定到直接結合蛋白,也能檢測到非直接結合蛋白,甚至捕捉到除蛋白質以外的小分子物質。
  • TAP標簽種類多樣,能根據研究需要選擇和設計標簽,技術適用廣泛且實用性強;

TAP技術局限性

  • TAP標簽本身對蛋白質結構可能存在影響;
  • TAP標簽可能會影響蛋白的表達水平(通過改變標簽的位置對解決這個問題有一定的幫助);
  • 由于組分之間的親和力不同,復合體中結合比較松的組分可能會在純化的漂洗過程中丟失;

TAP技術發展

隨著TAP技術的發展,越來越多的標簽供不同串聯組合,常見的TAP標簽有FLAG 標簽、金黃色葡萄球菌蛋白 A 的 2個 IgG 結合域(ProtA)、Strep 標簽、His 標簽、鈣調蛋白結合肽(calmodulin2binding peptide,CBP) 以及角質素結合結構域(chitin2binding domain,CBD)等。在選擇串聯標簽時應綜合考慮純化回收率、純度、對融合蛋白的結構和生物學的影響以及成本等因素。

在兩親和純化標簽之間存在酶切位點,該位點以煙草蝕紋病毒酶切點(TEV)最為常見,原因是TEV蛋白酶高效特異,基本不含其它細胞蛋白識別點,使用TEV蛋白酶切掉相關蛋白質的概率極低。

標簽融合的位置: 融合標簽可以加在靶蛋白的N端也可以加在靶蛋白的C端,通常推薦使用C-端TAP標簽,這樣可以使融合蛋白的表達在天然啟動子的控制下,蛋白表達不受影響(有的蛋白當其C端加上其它肽段后會影響該蛋白的功能,此時應利用N端TAP標簽)。如果不知如何選擇標簽,可以在實驗初始設計兩條融合蛋白(標簽位置一條在N端,一條在C端),以應對無法順利表達的問題。

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