表面等離子共振法(SPR)測定抗體親和力

表面等離子共振技術(surface plamon resonace technology,SPR)是上個世紀80年代發展起來的以生物傳感芯片(biosensor chip)為中心的一種新技術。此后人們開始研究用各種方法改進SPR的性能、簡化儀器系統,并試圖用SPR技術測量不同的生化物質,測試范圍包括:下載

  • DNA-DNA間的生物特異性相互作用
  • 蛋白質折疊機制的研究
  • 微生物細胞的檢測
  • 抗體-抗原分子親和力測定

本文對于表面等離子共振技術的原理和其在測定抗體親和力作了簡要的概述。

全內反射是一種普遍存在的光學現象。考慮一束平面光波從介質1表面進入到介質2中。入射光在介質1表面上一部分發生反射,另一部分則透射進介質2。入射角和透射角之間滿足關系式:表面等離子體共振原理

n1sinθ1=n2sinθ2

這里n1是介質1的折射率,n2是介質2的折射率。當入射角增大,增大到臨界角θc 時,這時的透射角為90°;當入射角繼續增大到大于臨界角時,光不再透射進介質2,也就是發生了全反射。由snell定律可知:

θ2=90°
θc=arcsin(n2/n1)

由上式可知,當n2<n1時,全反射就可能發生。從幾何光學的角度來看,當光發生全反射時,光會在介質1界面上完全反射而不進入介質2中。實際上,由于波動效應,有一部分光的能量會穿過界面滲透到介質2中,平行于界面傳播。這部分光場就是所謂的消失波。一般情況下隱失波在折射率小的介質中傳播一段距離,再回到折射率大的介質,使光的全部能量都回到第一介質中。如果隱失波的頻率與金屬表面振蕩的自由電子(即等離子)頻率一致,則金屬表面的等離子就吸收光能發生共振(surface plasmon resonance,SPR),使反射光強度減弱,這時的入射角為共振角(SPR角)。SPR隨金屬表面的折射率變化而變化,而折射率的變化又和結合在金屬表面的生物分子質量成正比,因而可通過對生物反應過程中SPR角的動態變化獲取生物分子相互作用的特異信號。

BIACORE表面等離子共振儀的構成與工作原理

BIACORE表面等離子共振儀基于SPR原理的新型生物傳感分析技術,它在不需使用熒光或同位素標記甚至無須純化各種生物組分的天然條件下,通過傳感器芯片實時監測各類生物分子如多肽、蛋白質、寡核苷酸、寡聚糖、類脂甚至全病毒、細胞之間相互作用的整個過程,并通過分析軟件獲取生物分子結合、解離、親和性、特異性、協同、拮抗、反應速率、濃度變化等互作動力學參數。
表面等離子共振儀主要由五部分組成:芯片、光學系統、液體處理系統、控溫系統和計算機軟件。其工作原理是基于SPR技術來實時追蹤生物分子間的相互作用。實驗時先將一種生物分子固定在傳感器芯片表面,再通過微射流卡盤將含有相互作用的分子溶液傳送至傳感器芯片表面,SPR光學檢測系統則跟蹤檢測溶液與芯片表面的分子結合和解離的全過程。數據分析軟件處理實驗過程中獲取的各種特異性信號,并將其整合成最終的實驗結果。由于其高度的自動化和靈敏特異性且具常規儀器方法難以比擬的實時,動態監測優點,所以被廣泛地應用于各種生命現象分子機理研究。
表面等離子共振儀結構

表面等離子共振儀芯片結構

在表面等離子共振儀中,最核心的結構是芯片。芯片的玻璃表面附有一層金膜,一種待檢分子(ligand)連在金膜上,入射光在金和玻璃表面發生全反射,并產生SPR,這時的入射角為I。當有一種分子analyte與ligand相互作用時,使金箔的折射率發生變化,這時以原來的入射角(I)入射就不能發生SPR,而以入射角(II)入射才能發生SPR。用楔形的入射光入射保證了入射角在一定范圍內,并能實時檢測。在analyte與ligand相互作用后,以緩沖液流過芯片表面,使analyte和ligand相分離,從而芯片得到再生,可以重復使用。
表面等離子共振儀工作原理

表面等離子共振儀工作原理

SPR用于抗體親和力相互作用的研究

SPR技術在抗體-抗原結合動力學及抗原表位-抗體對位的鑒定中有重要的應用,在無需純化和標記抗體-抗原的天然條件下,能實時動態反映抗體-抗原互作時的結合/解離速率和親和力常數。若測定的樣品為MAb時,可直接用雜交瘤細胞培養的上清液進行。其操作過程大致包括:首先將待測MAb所識別的抗原偶聯在傳感芯片表面,然后注入待測MAb,通過芯片表面直接監測抗體-抗原結合過程,通過結合曲線能夠快速半定量不同抗體的動力學參數。樣品注入后,出現的脈沖有明顯的開始和結束,在脈沖的前后端皆是連續的緩沖液在流動。從傳感圖上可以看到抗體-抗原復合物的結合過程和平衡狀態。當樣品注射完畢后,抗體被緩沖液代替時,可觀察到復合物的解離狀態,從結合量可以反映出抗體的濃度及結合的親和力,利用分析軟件能提供反應動力學常數及親和力等數據。以洗脫液(如稀酸或堿)再生傳感芯片后可進行下一輪分析。
SPR 傳感曲線

傳感圖曲線

與常規的親和力檢測方法(競爭ELISA,電泳條遷移等)相比,SPR具有以下優勢:

  • 實時(real-time)監測反應的動態過程,即在生物大分子相互作用過程中其有關的變化可時時刻刻的記錄在儀器上,而且其實驗結果的重現性無可比擬。
  • 檢測每對生物大分子相互作用的時間大約為10min左右,分析快速,而且全自動化進行,故其工作效率高,在短時間內可完成大量標本的檢測。
  • 在儀器上記錄的結果不能隨意更改,這不僅減少了主觀因素的影響,增加了客觀性,而且其結果重復性好。
  • 檢測溶液中的最低濃度為10-12mol/L,因此用樣量少,敏感性高。并可測其濃度、反應親和力、反應特異性及反應速度(動態參數)等。
  • 在檢測中的任何分子均無需純化和標記,故簡單易行。目前,這一類儀器的價格還比較昂貴,因此其推廣使用受到限制。而且,對儀器的操作一般需由專門受過培訓的人員進行。盡管如此,但由于該儀器具有的明顯優勢,并且可以提供許多傳統技術所不能提供的資料,因此該技術的出現為科學界、醫學界及藥物學的研究和發展拓展了新的空間。

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