細胞的穩定轉染

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穩定轉染的是將外源基因整合到細胞自身的基因組上,使外源基因成為細胞基因組的一部分而得以復制。對細胞進行穩定轉染最終可篩選得到穩定細胞株,穩定細胞株在重組蛋白/抗體生產、基因編輯、功能研究等方面起著重要的作用。本文主要介紹了細胞穩定轉染的原理、如何進行穩轉株篩選得到高表達的細胞株,同時還介紹了細胞穩轉的影響因素及穩定轉染的應用。

穩定轉染實驗流程

從實驗流程的角度看,穩定轉染是建立在瞬時轉染的基礎上的:先對哺乳動物細胞進行轉染,再對得到的細胞池進行篩選最終得到穩定細胞系。在建立穩定轉染細胞系時,我們需要使用選擇標記來區分瞬時轉染和穩定轉染,通常質粒中帶有選擇標記,選擇標記會與目的基因共表達,由此可以篩選出陽性克隆(外源基因已穩定整合至細胞的基因組上),同時剔除未穩定整合的細胞。最終通過有限稀釋得到穩定轉染的單克隆細胞株。

細胞復蘇

哺乳動物細胞穩轉株構建流程

細胞復蘇是將保存在液氮冰箱中的細胞株解凍并重新培養的過程,將哺乳動物細胞進行復蘇用于后續的細胞轉染。細胞復蘇的關鍵是快融,防止在解凍過程中,產生的水珠形成冰晶損傷細胞。(查看細胞復蘇及細胞傳代培養實驗操作

載體構建及細胞轉染

將目的基因構建至載體(載體需帶有抗性),隨后將構建好的質粒線性化。接著進行細胞轉染,用于轉染細胞的方式有多種,包括病毒轉染、脂質體轉染、電轉、基因槍法等,在瞬時轉染與穩定轉染實驗流程一文中介紹了脂質體轉染細胞的詳細實驗操作流程。

細胞池篩選

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轉染結束后即可得到細胞池,想要得到穩定轉染的單克隆細胞株需要對細胞池進行篩選:先利用抗性標記篩選穩定轉染的陽性克隆,再用有限稀釋法挑取單克隆株。另外如果想要得到高表達的穩定細胞株,需要對細胞池進行壓力篩選(GS篩選系統或DHFR篩選系統),最終得到表達能力高的穩轉細胞株。

穩定轉染實驗影響因素

  • 外源基因整合幾率:外源基因整合幾率決定了穩轉株篩選的簡易程度;
  • 拷貝數:一般情況下低拷貝或者單拷貝可以降低人為因素的干擾;
  • 結合位點:不同的整合位點決定了外源片段在染色體中的穩定性,有些區域易發生重組或者丟失,從而使穩轉株篩選后出現丟失的現象;
  • 整合位點轉錄活躍度:整合位點轉錄活躍度決定了穩轉株中外源基因片段的表達質量;

穩定轉染的應用

待解決的問題 解決方案
外源基因要整合到細胞染色體上 基因敲除以及基因插入突變篩選等修飾基因組的研究
細胞之間存在個體差異,同一類型細胞,不同個體細胞基因組存在差異,會對實驗結果造成干擾 單克隆穩轉株篩選
外源基因未整合到細胞會導致注射入動物體內后,外源基因片段很快丟失 需要在動物體體內注射已經表達外源基因的細胞
一些蛋白穩定性很強,瞬時RNA干擾作用周期短,無法去除已經表達的目的蛋白 需要通過穩轉株篩選,實現更好的基因干擾效果
穩轉株篩選很大程度上降低頻繁轉染或者病毒包裝的成本,也很大程度上方便實驗研究 在某些細胞中長期研究基因的功能
通過穩轉株篩選,能使那些病毒載體也無法達到高轉導效率的細胞高效表達外源片段 獲得外源片段的高效表達
避免引入人為因素影響實驗結果的精確性,穩轉株篩選有助于篩選出拷貝數適量的細胞 得到過表達的目的基因或干擾拷貝數

應用場景

瞬時轉染表達和穩定轉染表達最顯著的區別就是在時間上。瞬時轉染在轉染后四天即能收獲細胞,瞬時轉染一般用于基因產物的短期表達、蛋白質的小規模合成。相對于瞬時轉染,穩定轉染表達適用于長期的藥理學研究遺傳調控機制研究及大規模的蛋白質合成,需要大量的周期,因此更費力成本投入高。目前,在進行哺乳動物細胞蛋白表達時,因為細胞培養技術的進步和人們對瞬時轉染的不斷探索,人們已經可以對一些常用細胞進行懸浮培養,實現了瞬時轉染對重組蛋白的大規模合成,節省了時間和成本。

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