測序樣品分析與問題解決

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摘要:本文主要對測序中經常遇到的問題進行總結并提出解決方法,同時對測序樣品的要求作出分析,幫助我們在測序前對樣品做好準備,并在失敗的結果中找到解決方法。

下載

測序樣品分析

  1. 測序的樣品可以有PCR產物,菌(新鮮菌液、穿刺菌、平板菌、甘油菌),質粒。測序提供的樣品最基本的原則就是要保證樣品的量和純度。
  2. PCR產物測序,PCR產物測序的第一要素是PCR產物的純度,如果是PCR產物原液,則需要經過瓊脂糖凝膠電泳純化后再進行測序,如果不經過電泳產物回收純化這一步,測序容易出現亂峰或疊峰,如果是已經純化好的PCR產物,可直接測序。第二要素是引物,引物必須經過純化,純度至少大于90%。
  3. 菌液測序,需提供足量的新鮮的菌液,新鮮菌液成功率較高,測序公司可以直接提取質粒測序。
  4. 菌體可以是多種形式平板菌、穿刺菌。兩者都是在含有抗生素的固體培養基中,可用肉眼觀察到菌落并保證無雜菌污染。
  5. 質粒測序要提供一定濃度和量,注明名稱,酶切位點及片段大小。此外,小于100bp片段一般是先克隆再測序,直接測序較難得到結果。

測序問題與解決

  1. 測序信號衰減/中斷
  2. 測序信號衰減/中斷

    測序信號衰減或中斷是測序過程中的常見問題,原因多種多樣:模板中含有重復序列,或是模板含有高級結構所致,模板中GC含量過高等都有可能使測序信號衰減,此外,引物的質量,試劑失活也有可能造成此現象。解決方法:采用反向引物測序,通過序列拼接獲得全長,過程中可適當的加入DMSO,并使用高級試劑盒擴增。

  3. 測序出現重疊峰/亂峰
  4. 測序出現重疊峰/亂峰

    測序中間出現重疊峰(雙峰),是因為序列前面有連續的堿基出現,或是測序引物堿基缺失。如果一直出現重疊峰,就是序列本身有非特異性條帶,非特異性條帶的話就要從PCR擴增開始分析,注意提高PCR擴增的特異性,擴增可以選擇高特異性的Taq酶(如熱啟動酶),能夠大大的降低錯配,提高擴增序列的特異性。也可以做TA克隆,采用單克隆測序。測序的引物,最好自己提供,保證引物的特異性并防止降解(不要選擇通用引物),同時表明測序結果提供序列全長。

  5. poly結構測序結果亂峰/衰減/中斷
  6. Poly(A/T/C/G)結構的測序易出現移碼現象并導致測序信號衰減中斷,這是因為序列中有連續的堿基出現所致,建議采用反向引物測序獲得全長。

  7. 測序結果為空載體
  8. 目的片段插入失敗(提供的克隆為陽性克隆)或培養過程中目的片段丟失,只要重新挑取單克隆,進行PCR后送去測序即可。

  9. 測序引物
  10. 測序引物要求較高,理論上可以用PCR擴增時的引物測序,但不能測得全長,當測序完成時,可以從中間設計引物反向測一個,這樣便能得到序列全長。測序的引物3’端要和模板完全配對,長度16-22bp左右,GC含量50%左右,測序引物純度有很高要求,必須經過純化且純度至少大于90%。

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