SDS-PAGE電泳的基礎原理和實驗步驟

概述

十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳(sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis,簡稱SDS-PAGE)是聚丙烯酰胺凝膠電泳中最常用的一種蛋白表達分析技術。此項技術的原理,是根據檢體中蛋白質分子量大小的不同,使其在電泳膠中分離。在大腸桿菌表達純化外源蛋白的實驗中,SDS-PAGE更是必不可少的操作,其通常用于檢測蛋白的表達情況(表達量,表達分布),以及分析目的蛋白的純度等。
下載

SDS-PAGE作用機理

蛋白中含有很多的氨基(+)和羧基(-),不同的蛋白在不同的pH值下表現出不同的電荷,為了使蛋白在電泳中的遷移率只與分子量有關,我們在上樣前,通常會進行一些處理(上樣

緩沖液)。即在樣品中加入含有SDS 和β-巰基乙醇的上緩沖液。SDS 即十二烷基磺酸鈉

(CH3-(CH2)10-CH2OSO3- Na+),是一種陰離子表面活性劑,它可以斷開分子內和分子間的氫鍵,破壞蛋白質分子的二級和三級結構; β-巰基乙醇是強還原劑,它可以斷開半胱氨酸殘基之間的二硫鍵。電泳樣品加入樣品處理液后,經過高溫處理,其目的是將SDS 與蛋白質充分結合,以使蛋白質完全變性和解聚,并形成棒狀結構同時使整個蛋白帶上負電荷;另外樣品處理液中通常還加入溴酚藍染料,用于監控整個電泳過程;另外樣品處理液中還加入適量的蔗糖或甘油以增大溶液密度,使加樣時樣品溶液可以快速沉入樣品凹槽底部。當樣品上樣并接通兩極間電流后(電泳槽的上方為負極,下方為正極),在凝膠中形成移動界面并帶動凝膠中所含SDS負電荷的多肽復合物向正極推進。樣品首先通過高度多孔性的濃縮膠,使樣品中所含SDS 多肽復合物在分離膠表面聚集成一條很薄的區帶(或稱積層)。

電泳啟動時,蛋白樣品處于pH6.8 的上層,pH8.8 的分離膠層在下層,上槽為負極,下槽為正極。出現了 pH 不連續和膠孔徑大小不連續:啟動時Clˉ解離度大,Proˉ解離度居中,甘 aaCOOˉ解離度小,遷移順序為(pH6.8)Clˉ> Proˉ >—COOˉ。在 Clˉ與 Proˉ之間和 Proˉ與—COOˉ之間都將出現低離子區,同時也出現高電勢,高電勢迫使 Proˉ向 Clˉ遷移,—COOˉ向 Proˉ遷移。如:一個 Clˉ領路,—COOˉ推動,蛋白在中間,這樣就起到濃縮的作用了。在濃縮膠運動中,由于膠聯度小,孔徑大,Proˉ受阻小,因此不同的蛋白質就濃縮到分離膠之上成層,起濃縮效應,使全部蛋白質處于同一起跑線上。當蛋白質進入分離膠時,此時Proˉ,Clˉ,甘 aa 離子在 pH8.8 的溶液中,Clˉ完全電離而很快到達正極,甘 aa 電離度加大很快躍過蛋白質,而到達正極,只有蛋白質分子在分離膠中較為緩慢的移動。由于 Proˉ在電泳過程中,受到溶液離子的變化而 pH 值發生變化,但每一瞬間,其所帶電荷數除以單位質量是不同的,所以帶負電荷多者遷移快,反之則慢,這就現了電荷效應。由于膠孔徑小,而且成為一個整體的篩狀結構,它們對大分子阻力大,小分子阻力小,起著分子篩效應,也就是蛋白質在分離膠中,以分子篩效應和電荷效應而出現遷移率的差異,最終達到彼此分開。

PAGE 膠的聚合原理:甲叉雙丙烯酰胺和丙烯酰胺在過硫酸胺的作用下聚合,形成膠,如下圖:

SDS-PAGE聚合

注:催化劑:過硫酸銨(AP)在隔氧的狀態下,最好現配現用,使用新鮮的。

加速催化劑:TEMED,四甲基乙二胺。催化劑的作用是使單體聚合成網狀聚合物。

SDS聚丙烯酰胺凝膠的分離范圍:

丙烯酰胺濃度(%) 線性分離范圍(KD)
15 10~ 43
12 12~ 60
10 20~ 80
7.5 36~ 94
5.0 57~212

試劑及主要器材

通常在SDS-PAGE電泳實驗中用到以下幾種試劑:

1、主要試劑

  • ?30%凝膠貯備液:丙烯酰胺(Acr)29.2g,亞甲基雙丙烯酰胺(Bis)0.8g,加雙蒸水至100mL。外包錫紙,4℃冰箱保存,30天內使用。
  • 分離膠緩沖液(1.5mol/L): Tris 18.17g,加雙蒸水溶解,6mol/L HCl調pH8.8,定容100mL。4℃冰箱保存
  • 濃縮膠緩沖液(0.5mol/L): Tris 6.06g,加水溶解,6mol/L HCl調8,并定容到100mL。4℃冰箱保存
  • 電極緩沖液(pH8.3):SDS lg,Tris 3g,Gly 14.4g,加雙蒸水溶解并定容到1000mL。4℃冰箱保存。
  • 10%SDS,室溫保存
  • 質量濃度10%過硫酸銨(新鮮配制)
  • 上樣緩沖液:5mol/L Tris-HCl pH6.8 ?1.25mL,甘油2mL,10%SDS 2mL,β-巰基乙醇1mL,0.1%溴酚藍0.5mL,加蒸餾水定溶至10mL。
  • 考馬斯亮藍R-250染色液(1L):1g考馬斯亮藍R250,加入450甲醇,100ml冰醋酸
  • 脫色液(1L):100ml甲醇,100ml冰醋酸
  • 未知分子量的蛋白質樣品(1mg/mL )

2、實驗器材

  • 垂直板電泳槽
  • 電泳儀
  • 長滴管及微量加樣器
  • 燒杯(250mL、500m1)、量筒(500mL、 250m1)、培養皿(15cm′l5cm)
  • 槍頭(1ml、200ul、10ul)
  • 注射器等

SDS-PAGE所需溶液:

A液——30%丙稀酰胺(W/V):丙稀酰胺29.2g,N-N-甲叉雙丙稀酰胺0.8g,加入去離子水定容至100mL,pH值不能超過7.0,過濾于棕色玻璃瓶中4℃貯存。

B液——1.5mol/L ?Tris·HCl,pH8.8:18.17g(9.09g)Tirs堿,溶于60mL(30mL)去離子水中,加入約3mL(1.5mL)以上的濃鹽酸調節pH值至8.8,定容至100mL(50mL)。

C液——1.5mol/L ?Tris·HCl,pH6.8:12.1g(6.05g)Tirs堿,溶于60mL(30mL)去離子水中,加入約7mL(3.5mL)以上的濃鹽酸調節pH值至6.8,定容至100mL(50mL)。

D液——10%SDS:10g (2g)SDS溶于去離子水中,定容至100mL(20mL),加熱至68℃助溶。

E液——10%過硫酸銨:5g(0.5g)過硫酸銨,溶于50mL(5mL)去離子水中;現配現用或分裝至0.5mL離心管中冷凍備用。

F液——TEMED(N-N-N`-N`-四甲基乙二胺)原液,低溫保存。

聚丙烯酰胺(Acrylamide)的作用:丙烯酰胺與為蛋白質電泳提供載體,其凝固的好壞直接關系到電泳成功與否,與促凝劑及環境密切相關。

制膠緩沖液:濃縮膠選擇pH6.7,分離膠選擇pH8.9,選擇TRIS-HCL系統。

TEMED與AP:AP提供自由基,TEMED是催化劑,催化自由基引起的聚合反應進行。

十二烷基硫酸鈉(SDS):陰離子去污劑,作用有四:去蛋白質電荷、解離蛋白質之間的氫鍵、取消蛋白分子內的疏水作用、去多肽折疊。

注意:丙烯酰胺具有很強的神經毒性并可以通過皮膚吸收,其作用具累積性。稱量丙烯酰胺和亞甲雙丙烯酰胺(N,N’-Methylenebisacrylamide)時應戴手套和面具。可認為聚丙烯酰胺無毒,但也應謹慎操作,因為它還可能會含有少量未聚合材料。

SDS-PAGE實驗標準操作流程

1. 清洗玻璃板

一只手扣緊玻璃板,另一只手蘸點洗衣粉 ?輕輕擦洗。兩面都擦洗過后用自來水沖,再用蒸餾水沖洗干凈后立在筐里晾干。

2. 灌膠與上樣

  • 玻璃板對齊后放入夾中卡緊。然后垂直卡在架子上準備灌膠。(操作時要使兩玻璃對齊,以免漏膠。)
  • 配 12%分離膠,加入 TEMED 后立即搖勻即可灌膠。灌膠時,可用 3ml的吸管或10ml 槍吸取適量的膠沿玻璃放出,待膠面升到綠帶中間線高度時即可。然后膠上加一層水,液封后的膠凝的更快。(灌膠時開始可快一些,膠面快到所需高度時要放慢速度。操作時膠一定要沿玻璃板流下,這樣膠中才不會有氣泡。加水液封時要很慢,否則膠會被沖變型。)

分離膠和濃縮膠的制備:按下表中溶液的順序及比例,配置12%的分離膠和5.1%的濃縮膠。

試劑名稱 12%的分離膠(8塊,35ml) 5.1%的濃縮膠(8塊,12ml)
30%凝膠貯備液/ml 14 2
分離膠緩液

(pH8.8)/ml

8.75
濃縮膠緩沖液(pH6.8)/ml 3
雙蒸水/ml 12.25 6.9
10%過硫酸銨/ul 175 100
TEMED/ul 15 10

注:分離膠與濃縮膠的濃度計算公式:

A%*Va/V總 =C ,A%為30%凝膠貯備液,

例如,12%的分離膠:0.3*10/25=12%

  • 當水和膠之間有一條折射線時,說明膠已凝了。再等 3min 使膠充分凝固就可倒去膠上層水并用吸水紙將水吸干。
  • 按前面方法配 5.1%的濃縮膠,加入 TEMED 后立即搖勻即可灌膠。將剩余空間灌滿濃縮膠然后將梳子插入濃縮膠中。灌膠時也要使膠沿玻璃板流下以免膠中有氣泡產生。插梳子時要使梳子保持水平。由于膠凝固時體積會收縮減小,從而使加樣孔的上樣體積減小,所以在濃縮膠凝固的過程中要經常在兩邊補膠。待到濃縮膠凝固后,兩手分別捏住梳子的兩邊豎直向上輕輕將其拔出。
  • 用水沖洗一下濃縮膠,將其放入電泳槽中。(小玻璃板面向內,大玻璃板面向外。若只跑一塊膠,那槽另一邊要墊一塊塑料板且有字的一面面向外。)
  • 測完蛋白含量后,計算含 50μg 蛋白的溶液體積即為上樣量。取出上樣樣品至 0.5ml 離心管中,加入 5×SDS 上樣緩沖液至終濃度為 1×。(上樣總體積一般不超過 15μl,加樣孔的最大限度可加 20μl 樣品。)上樣前要將樣品于沸水中煮 5min 使蛋白變性。
  • 加足夠的電泳液后開始準備上樣。(電泳液至少要漫過內測的小玻璃板。)用微量進樣器貼壁吸取樣品,將樣品吸出不要吸進氣泡。將加樣器針頭插至加樣孔中緩慢加入樣品。(加樣太快可使樣品沖出加樣孔,若有氣泡也可能使樣品溢出。加入下一個樣品時,進樣器需在外槽電泳緩沖液中洗滌3 次,以免交叉污染。

3.?電泳

加樣完畢,蓋好上蓋,連接電泳儀,打開電泳儀開關后,樣品進膠前電壓控制在100~200V,大約15~20min;樣品中的溴酚藍指示劑到達分離膠之后,電壓升到200V,電泳過程保持電壓穩定。當溴酚藍指示劑遷移到距前沿1~2cm處即停止電泳,約0.5-1小時。如室溫高,打開電泳槽循環水,降低電泳溫度。

電泳。

4.?染色、脫色

電泳結束后,關掉電源,取出玻璃板,在長短兩塊玻璃板下角空隙內,用刀輕 輕撬動,即將膠面與一塊玻璃板分開,然后輕輕將膠片托起,指示劑區帶中心插入銅絲作為標志,放入大培養皿中染色,使用0.25%的考馬斯亮藍染液,染色2~4h,必要時可過夜。

棄去染色液,用蒸餾水把膠面漂洗幾次,然后加入脫色液,進行擴散脫色,經常換脫色液,直至蛋白質帶清晰為止。

5.?結果處理

  • 測量脫色后凝膠板的長度和每個蛋白質樣品移動距離(即蛋白質帶中心到加樣孔的距離),測量指示染料遷移的距離。
  • 按以下公式計算蛋白質樣品的相對遷移率(Rm)

相對遷移率=樣品遷移距離(cm)/染料遷移距離(cm)

  • 標準曲線的制作:以各標準蛋白質相對遷移率為橫坐標,蛋白質分子量的對數為縱坐標在半對數坐標紙上做圖,得到一條標準曲線。
  • 測定蛋白質樣品的分子量:根據待測蛋白質樣品的相對遷移率,從標準曲線上查得該蛋白質的分子量。

SDS-PAGE電泳實驗流程圖
SDS-PAGE電泳實例圖

注意事項

  • APS和TEMED是促凝的,根據溫度加入的量是可以變動,一般不超過30%。
  • ?玻璃板一定要洗干凈,否則制膠是會有氣泡。
  • 聚丙烯酰胺具有神經毒性,操作時注意安全,戴手套。(凝膠以后,聚丙烯酰胺毒性降低。)
  • 凝膠的時間要嚴格控制好,一般在20-30min。
  • ?點樣時,如果孔比較多,盡量點在中央。(點在邊上時,跑出的帶是斜的)
  • 點樣前要排盡膠底部的氣泡,防止干擾電泳。
  • 電泳結束后,取膠時,小心把玻璃板翹起(防止再次落下)。
  • 脫色時,盡量多次進行換水。
  • 上樣量不宜太高,蛋白含量每個孔控制在10μg-50μg,,一般<15μl。
  • 做膠時,凝膠時間控制在25min。梳子需一次平穩插入,梳口處不得有氣泡,梳底需水平。
  • 上樣時,Marker最好標在中間,邊上的孔盡量不要上樣。
  • 制膠時,在加APS前盡量不要攪拌,加入APS后可以輕輕攪拌,不要產生氣泡。
  • 分離膠緩沖液的pH一定要準確,盡量在20℃左右調掉8.8
  • 安裝電泳槽時要注意均勻用力旋緊固定螺絲,防止夾壞玻璃板,避免緩沖液滲漏。
  • 凝膠配制過程要迅速, 催化劑TEMED要在注膠前再加入,否則凝結無法注膠。注膠過程最好一次性完成,避免產生氣泡。
  • 微量注射器(加樣器)上樣時, 注射器不可過低,以防刺破膠體;也不可過高, 樣品下沉時易發生擴散,溢出加樣孔。
  • 剝膠時要小心,保持膠完好無損,染色要充分。

注意:溫度,時間,光照,APS和TEMED都會對凝膠產生影響

查看SDS-PAGE實驗FAQ:SDS-PAGE常見問題(FAQ)

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