SDS-PAGE電泳的常見問題解析(FAQ)

1.關于凝膠的一些問題

下載

  1. 膠的凝結不好,例如有花紋特別是濃度高的膠在冬天溫度較低的情況下,在分離膠的下部有波浪樣的花紋,凝膠不均勻。解決方法:加大TEMED和過硫酸胺的量,使其凝結速度加快。同時洗干凈玻璃板,防止有殘留的膠干結在玻璃板上。
  2. 膠不凝,解決方法:溫度較低時加大TEMED和過硫酸胺的量,過硫酸胺必須新鮮配制。如若還是不行重新配制一下緩沖溶液。
  1. 膠易碎,例如濃度較高的膠在染色和脫色過程以及掃描過程中破裂。解決方法:首先在上述過程中一定要動作輕緩,其次在室溫較高的情況下可以適當減少TEMED和過硫酸胺的量。
  2. 電泳完后膠上有很多長條紋的雜帶,解決方法:建議電泳緩沖液不要回收利用。配制膠的溶液一定要純。

2.凝膠時間不對

通常膠在30分鐘到1小時內凝。如果凝的太慢,可能是TEMED,AP劑量不夠。 如果凝的太快,可能是AP和TEMED用量過多,此時膠太硬易裂,電泳時易燒膠。

3.濃縮膠與分離膠斷裂、板間有氣泡對電泳的影響

前者主要原因是拔梳子用力不均勻或過猛所致;后者是由于在解除制膠的夾子后,板未壓緊而致空氣進入引起的,一般對電泳結果不會有太大的影響。

4.樣品的處理

根據樣品分離目的不同,主要有三種處理方法:還原SDS處理、非還原SDS處理、帶有烷基化作用的還原SDS處理。

  1. 還原SDS處理:在上樣buffer中加入SDS和DTT(或Beta巰基乙醇)后,形成SDS與蛋白相結合的分子。
  2. 帶有烷基化作用的還原SDS處理:碘乙酸胺的烷基化作用可以很好的保護SH基團,得到較窄的譜帶;另碘乙酸胺可捕集過量的DTT,而防止紋理現象的產生。100uL樣品緩沖液中加入10uL20%的碘乙酸胺,并在25℃下保藏30min。
  3. 非還原SDS處理:生理體液、血清、尿素等樣品,一般只用1%SDS沸水中煮3min,未加還原劑,因而蛋白折疊未被破壞,不可作為測定分子量來使用。

5.條帶兩邊翹起中間凹下的原因(︶)

在較厚的凝膠中,由于凝膠不均勻冷卻,中間部分凝固不好。

電泳系統溫度偏高。

處理辦法:待其充分凝固再作后續實驗。

6.條帶兩邊向下中間鼓起的原因(︵)

一般原因是兩板之間的底部間隙氣泡未排除干凈,或聚合不完全。

處理辦法:可在兩板間加入適量緩沖液,以排除氣泡。

7.條帶偏斜

原因:電極不平衡或者加樣位置偏斜。

8.條帶兩邊擴散

原因:加樣量過多。

9.電泳的條帶過粗

電泳中條帶很粗是常見的事,主要是濃縮膠的原因。

處理辦法:適當增加濃縮膠的長度;保證濃縮膠貯液的pH正確;適當降低電壓。

10.目的蛋白質條帶模糊

  1. 電泳凝膠濃度選擇不當。
  2. 低于10Kd的小分子蛋白質要用Tricine膠。
  3. 靠近前沿的電泳帶分辨率不佳。根據分子量與凝膠孔徑的關系,選擇適當濃度的凝膠。
  4. 蛋白質樣品水解。注意除去蛋白質樣品的內源性的水解酶,不要反復凍融。
  5. 電泳時間過長或過短。溴酚藍達到分離膠的底部即應該關閉電泳電源。
  6. 緩沖溶液、SDS都要新鮮配制。
  7. 避免加樣過多,提高分辨率。小體積樣品可給出窄帶,加樣體積根據樣品濃度和凝膠厚度靈活掌握。一般上樣體積為10-15uL(即2-10ug蛋白質)。
  8. 加熱變性后的蛋白質樣品要放置到室溫即電泳,不要久放,因為蛋白質的二硫鍵在高溫下可能是會斷開,但是暴露于空氣中溫度降低會重新形成二硫鍵,而且可能在過久放置過程中蛋白質可能會再折疊,更不要扔到冰箱里保存。

11.“鬼帶”的出現及處理

“鬼帶”就是在跑構象復雜的蛋白質大分子時,在泳道頂端出現一些未知條帶或在加樣孔底部生成沉淀,這主要是因為還原劑在加熱的過程中被氧化失活,使解離的蛋白質分子重新折疊和亞基重新締合,由于其分子量通常要比目標條帶大,所以會生成未知條帶或沉淀。

處理辦法:在加熱煮沸后,再添加適量的DTT或Beta巰基乙醇,以補充不足的還原劑;或可加適量EDTA來阻止還原劑的氧化。

12.拖尾現象

主要是樣品溶解效果不佳或分離膠濃度過大引起的。

處理辦法:加樣前離心;選擇適當的樣品緩沖液,加適量樣品促溶劑;電泳緩沖液時間過長,重新配制;降低凝膠濃度。

13.紋理現象

主要是樣品不溶性顆粒引起的。

處理辦法:加樣前離心;加適量樣品促溶劑。

14.溴酚藍不能起到指示作用

我們在實驗中有時會出現溴酚藍已跑出板底,但蛋白質卻還未跑下來的現象。

主要原因:緩沖液和分離膠的濃度過高。

處理辦法:更換正確pH值的Buffer;降低分離膠的濃度。

15.甘氨酸在電極緩沖液中的作用

SDS-PAGE中樣品液和濃縮膠選TRIS/HCL緩沖液,電極液選TRIS/甘氨酸,電泳開始后,HCL解離成氯離子,甘氨酸解離出少量的甘氨酸根離子。蛋白質帶負電荷,因此一起向正極移動,其中氯離子最快,甘氨酸根離子最慢,蛋白居中。電泳開始時氯離子泳動率最大,超過蛋白,因此在后面形成低電導區,而電場強度與低電導區成反比,因而產生較高的電場強度,使蛋白和甘氨酸根離子迅速移動,形成以穩定的界面,使蛋白聚集在移動界面附近,濃縮成一中間層。

16.電泳電壓很高但電流很低

現象:電壓50v以上,可電流卻在5mA以下。

主要原因:電泳槽沒有正確裝配,電流未形成通路。包括:內外槽裝反;外槽液過少等。

處理辦法:正確裝配電泳槽即可。

17.如何提高SDS-PAGE電泳分辨率

使聚丙烯酰胺的充分聚合,可以提高凝膠的分辨率。

建議做法:待凝膠在室溫凝固后,可在室溫下放置一段時間使用。忌即配即用或冰箱放置,前者易導致凝固不充分,后者可導致SDS結晶。

18.電泳時間比正常要長

可能是因為凝膠緩沖系統和電級緩沖系統地PH選擇錯誤,即緩沖系統地PH和被分離物質的等電點差別太小,或緩沖系統的離子強度太高。

19.配膠緩沖液系統在電泳中的影響

緩沖液在電泳過程中的主要作用是維持合適的pH。電泳時正極與負極都會發生電解反應,正極發生的是氧化反應,負極發生的是還原反應,長時間的電泳將使正極變酸,負極變堿。緩沖液可以維持溶液兩極的pH保持基本不變。在濃縮膠中,pH環境呈弱酸性,因此甘氨酸解離很少,泳動效率低;而CL離子卻很高,兩者之間形成導電性較低的區帶,蛋白分子就介于二者之間泳動并聚集到一起,濃縮為一狹窄的區帶。所以,pH對整個反應體系的影響是至關重要的,實驗中在排除其他因素之后仍不能很好解決問題的情況,應首要考慮該因素。

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