噬菌體表面展示制備scFv

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單鏈抗體(scFv)是由抗體重、輕鏈的可變區基因通過一段編碼約5-25個AA的連接肽基因(linker)拼接后表達形成的重組蛋白。scFv具有分子量小、組織穿透力強、體內循環半衰期短、免疫原性低、易于進行基因工程改進等優點,在疾病臨床診斷、治療、預防等方面具有重要作用。利用噬菌體展示技術,可以制備得到高親和力、結構穩定的scFv抗體。本文對常用的scFv噬菌體展示系統及scFv噬菌體抗體庫構建篩選做一介紹。

pCANTAB 5E噬菌體展示系統

人們利用噬菌體展示技術制備scFv噬菌體抗體庫,經噬菌體抗體庫篩選得到的噬菌體抗體通常具有較高的穩定性。pCANTAB 5E噬菌體展示系統是scfv噬菌體表面展示最常用的系統,該系統由噬菌粒載體(pCANTAB 5E)、宿主菌(大腸桿菌TG1、HB2151等)、輔助噬菌體M13K07等部分組成。

噬菌粒載體:pCANTAB 5E是scFv噬菌體表面展示最常用的噬菌粒載體,大小為4522bp,具體圖譜及酶切位點如下所示:

pCantab5E噬菌粒載體圖譜

圖1:pCANTAB 5E噬菌粒載體圖譜

宿主菌:pCANTAB 5E系統中宿主菌有大腸桿菌TG1及大腸桿菌HB2151兩種,噬菌粒侵染兩種宿主菌會得到兩種不同的產物,侵染大腸桿菌TG1最終可得到scfv-plll融合蛋白,侵染大腸桿菌HB2151最終可得到可溶性的scFv蛋白。原因是在噬菌粒載體的目的基因插入位點末端有一段E-Tag短肽,短肽后有琥珀終止密碼子,TG1菌株對琥珀終止密碼子具有抑制性,蛋白翻譯可通過琥珀終止密碼繼續翻譯下游的Plll基因,最終產生scfv-plll融合蛋白,HB2151為非抑制株大腸桿菌,蛋白的合成在ScFv基因后即停止,最終會得到可溶性的scFv蛋白。

輔助噬菌體:M13K07輔助噬菌體是pCANTAB 5E噬菌體展示系統的重要組成部分。噬菌體轉入宿主細胞后想要順利傳代必須要有輔助噬菌體的參與。

scFv噬菌體抗體庫構建及篩選

1. 制備scFv基因庫

收集目標抗體宿主的免疫細胞(B淋巴細胞、致敏B淋巴細胞、非致敏B淋巴細胞等),提取總RNA,經RT-PCR分別擴增出抗體的VH和VL編碼基因,純化回收VH和VL片段,使用Linker引物將全套VH和VL基因隨機拼接成scFv基因庫。

VH和VL的拼接方法目前有兩種:

  • 將 Linker設計在表達載體上,兩端各有限制性內切酶酶切位點供VH和VL插入;
  • 把 Linker的編碼序列分別設計在擴增VH和VL引物中,用PCR直接合成ScFv基因:VH和VL通過 Linker互補序列,互為引物及模板合成完整的ScFv基因,再以兩端的引物進行PCR擴增得到大量的ScFv基因產物。該方法被稱為重疊延伸拼接法( splicing by overlap extension,SOE)

2. 將scFv基因轉入噬菌體

將scFv基因轉入噬菌體內,可以直接將scFv基因轉到噬菌體基因上,也可以將scFv基因轉入噬菌粒載體中。通常直接將scFv基因轉入噬菌體體內的效率很低,比較常用的是第二種方式,將scFv基因連接至pCANTAB 5E載體上,構建噬菌粒。

3. 侵染宿主菌

噬菌粒構建完成后,便可進行宿主菌的侵染。宿主菌有大腸桿菌TG1及大腸桿菌HB2151兩種,如果宿主為TG1,最終得到scfv-plll融合蛋白,并展示在噬菌體表面。如果宿主為HB2151,最終得到scFv蛋白,ScFv蛋白被排到細胞周質空間,因為缺少plll基因結構域而不能連接到噬菌粒顆粒上,經擴大培養可溶性抗體片段在周質空間積累并溢至培養液中。

噬菌粒轉入宿主菌后,可在宿主菌體內自我復制,但由于缺少必要的功能基因,噬菌粒無法合成單鏈DNA、無法進行傳代。為了使噬菌體順利傳代,在宿主菌生長至對數生長期后,需要進行輔助噬菌體超染。輔助噬菌體可以為噬菌粒提供必要的功能基因(pⅡ蛋白、包裝蛋白等),促使質粒合成單鏈DNA并完成傳代。(輔助噬菌體工作原理

4. 獲得scFv抗體庫

輔助噬菌體超染宿主菌后,噬菌體開始傳代并裂解宿主菌,培養過夜離心收集上清即可獲得噬菌體scFv抗體庫;

5. 篩選噬菌體抗體庫,得到高親和力的scFv

以靶蛋白為固定相,以抗體庫為流動相,經過一段時間的共同孵育后,洗去未結合的游離噬菌體,然后以競爭受體洗脫下與靶分子結合吸附的噬菌體,洗脫的噬菌體感染宿主菌后經繁殖擴增,進行下一輪洗脫,經過3輪~5輪的“吸附-洗脫-擴增”后,即可篩選出與靶蛋白具有高親和性且結構穩定的scFv蛋白。

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