逆轉錄PCR

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逆轉錄是指以RNA為模板合成與其互補的cDNA的過程。逆轉錄PCR是將RNA的逆轉錄(reverse transcription) 和cDNA的聚合酶鏈式反應(PCR)相結合的技術,故逆轉錄稱為RT-PCR或反轉錄PCR。逆轉錄PCR實驗原理是,提取組織或細胞中的總RNA,以RNA為模板,利用逆轉錄酶反轉錄成cDNA,再以cDNA鏈為模板進行PCR擴增,從而獲得大量拷貝。逆轉錄PCR的出現使RNA檢測的靈敏性提高了幾個數量級,使一些極為微量RNA樣品分析成為可能。

逆轉錄PCR應用

逆轉錄PCR的用途廣泛,可用于分析基因的轉錄產物、檢測細胞中RNA病毒的含量、合成cDNA探針、直接克隆特定基因的cDNA序列等。如在臨床上RT-PCR可以用于遺傳病診斷、癌癥檢測、檢測病人標本中的RNA病毒,如HAV、HCR、HIV等。在植物方面RT-PCR常用于研究環境脅迫對植物基因表達的影響,以及在特定的環境或生長階段中植物體不同部位基因表達的差異性。使用RT-PCR檢測分析RNA轉錄產物具有以下突出的優點:

  • 理論上可以檢測幾乎任何基因的轉錄產物;
  • 可以實現極為微量RNA樣品(ng級別)的檢測;
  • 樣品耐受性好,未經純化的粗制生物樣品也可以用于檢測;

模板

逆轉錄PCR的模板是RNA,可以是總RNA、mRNA或體外轉錄的RNA產物。無論使用何種RNA,都需確保RNA中無RNA酶和基因組DNA的污染。

RNA提取

可以利用試劑盒從細胞(或組織)中提取得到RNA。模板RNA的純度和完整性對于擴增的結果有很大影響,從細胞中分離RNA應注意盡量減少RNA酶的污染(RNA酶分布廣泛,除細胞內源性RNA酶外環境中也存在大量RNA酶),在提取RNA時,應盡量創造一個無RNA酶的環境:避免RNA酶污染包括去除外源性RNA酶污染和抑制內源性RNA酶活性,主要是采用焦碳酸二乙酯(DEPC)去除外源性RNA酶,通過RNA酶的阻抑蛋白Rnasin和強力的蛋白質變性劑抑制內源性RNA酶。

引物

用于反轉錄的引物有隨機引物、通用引物(Oligo-dT)及基因特異性引物三種,下表為三種引物的介紹:

引物 適用范圍
隨機引物 適用于長的或具有發卡結構的RNA。適用于rRNA、mRNA、tRNA等所有RNA的反轉錄反應。主要用于單一模板的RT-PCR反應
Oligo-dT 適用于具有PolyA尾巴的RNA(原核生物的RNA、真核生物的rRNA和tRNA不具有PolyA尾巴)
基因特異性引物 與模板序列互補的引物,適用于目的序列已知的情況

引物最好選擇Oligo-dT或基因特異性引物,隨機引物會從RNA的多個位點(包括核糖體RNA)開始轉錄,特異性低。Oligo-dT引物同大多數真核細胞mRNA3’端的poly(A)尾雜交,與使用隨機引物相比特異性高。但是Oligo-dT引物對RNA樣品的質量要求較高,對于從福爾馬林固定的組織中提取的劣質RNA不適合用Oligo-dT引物。

逆轉錄酶

逆轉錄酶是存在于RNA病毒體內的依賴RNA的DNA聚合酶。RT-PCR實驗中的逆轉錄酶需要具有以下二種活性:

  1. 依賴RNA的DNA聚合酶活性:以RNA為模板合成cDNA的第一條鏈
  2. 依賴DNA的DNA聚合酶活性:以一條DNA鏈為模板合成互補的雙鏈DNA

在選擇逆轉錄酶時,建議選擇無RNaseH 活性(RNaseH-)的逆轉錄酶。具有RNaseH活性的逆轉錄酶的RNaseH活性會與聚合酶活性競爭RNA模板與DNA引物(或cDNA延伸鏈)形成的雜合鏈,并降解雜合鏈中的RNA鏈。被RNaseH活性所降解的RNA模板不能再作為合成cDNA的有效底物,降低了cDNA合成的產量與長度。

實驗流程

從細胞材料中提取RNA→RNA加入到含有逆轉錄酶、引物、dNTPs的反應體系中→退火,引物與RNA鏈配對→延伸,逆轉錄酶合成互補cDNA鏈變性→常規PCR反應流程(變性、退火、延伸,如此多次循環)。

RT-PCR“兩步法”與“一步法”

RT-PCR的實驗操作分為“一步法”與“兩步法”兩種。一步法RT-PCR能克隆微量mRNA而不需構建cDNA文庫(即cDNA合成與PCR反應在同一Buffer及酶中進行,一步法完成),省略了cDNA與PCR之間的過程。兩步法RT-PCR首先用反轉錄酶合成cDNA,然后以cDNA為模板進行PCR,即RNA反轉錄與PCR擴增分兩步進行。一步法與兩步法具有以下區別:

  • 一步法比兩步法更快速、簡便、減少了污染機會、減少了RNA二級結構、減少了PCR反應的錯配率;
  • 兩步法的優勢在于中間產物cDNA,便于保存;且第二步PCR只取逆轉錄反應產物的1/10進行反應,有利于PCR條件的調整,實驗重現性強;
  • 兩步法可以在第二步PCR反應體系中加入特異性引物,其靈敏度比一步法高;
  • 兩步法包括第一鏈cDNA合成和隨后的PCR反應,容易產生污染問題;
  • 兩步法的實驗預算要低于一步法。

RT-PCR兩步法與一步法比較

圖2:“一步法”與“兩步法”比較

實驗操作注意事項

  • RNA提取一定要迅速,樣本要新鮮,組織盡量在液氮中研磨;
  • RNA提取完馬上進行逆轉錄不要拖延,新提的RNA很容易降解;
  • 逆轉錄反應過程,需建立無RNAase環境,以避免模板RNA降解;

注:

① RNase是RNA水解酶的統稱,包含RNase A,RNase H等,RNase A可以水解單雙鏈RNA,RNase H主要水解RNA與DNA雜交雙鏈中的RNA

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參考文獻

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