重組蛋白分離純化的方法策略及案例介紹

下載

分離純化處于重組蛋白表達的下游處理(downstream processing)階段,且與上游過程緊密相聯,如是否帶有親和標簽,是否進行分泌表達等。所以在對目的蛋白表達純化時,要統一考慮和整體設計,并充分考慮上游對下游的影響。同時,不同的表達系統和培養方法也影響下游的處理過程:目的蛋白表達是否形成包涵體,目的蛋白表達定位(胞內、細胞膜內、周質空間和細胞外)

重組蛋白表達策略

表達策略 優點 缺點
分泌表達至細胞外 增強正確二硫鍵的形成
降低蛋白酶對表達蛋白的降解
可獲得確定的N末端
顯著減少雜蛋白水平,簡化純化
不需要細胞破碎
表達水平低
多數蛋白不能進行分泌表達
表達蛋白需要濃縮
細胞周質空間表達 增強二硫鍵正確形成
可獲得確定N末端
顯著減少雜蛋白水平,簡化純化
一些蛋白不能分泌進入周質空間
沒有大規模選擇性地釋放周質空間蛋白的技術
周質蛋白酶可引起重組蛋白的酶解
細胞內包涵體表達 包涵體易于分離
保護蛋白質不被降解
需要體外的折疊和溶解,得率較低
具有不確定N末端
細胞內可溶性蛋白表達 蛋白質不具有活性,對宿主細胞生長沒有大影響
通常可獲得高表達水平
不需要體外溶解和折疊
一般具有正確的結構和功能
高水平的表達難以得到
需要復雜的純化
可發生蛋白質酶解
具有不確定N末端

由上表可知選擇將所表達的蛋白分泌到細胞外或周質空間可避免破碎細胞的步驟,而且細胞外和周質空間內的蛋白種類較少,目的蛋白易純化;而在細胞質內表達重組蛋白時,重組蛋白通常是可溶性表達,但也易形成包涵體。可溶性蛋白往往需要復雜的純化步驟,而包涵體易于分離且純度較高,但回收具有生物活性的蛋白質卻變得相當困難,通常需要對聚集的蛋白進行變,復性,而通常情況下活性蛋白的得率比較低。德泰生物憑借多年的蛋白表達服務操作經驗和相關的技術,可以提供可溶性重組蛋白保證型服務和更高純度的上清蛋白。

色譜法分離純化蛋白質

色譜法又稱層析法,是利用不同物理化性質的差異而建立起來的技術。所有的色譜系統都由倆個相組成:固定相(固體物質或固定于固體物質上的成分)和流動相(水和其他溶劑)。當待分離的混合物隨流動相通過固體相時,各組分與倆相發生相互作用(吸附,溶解,結合)并因作用力的不同導致流出時間上的差異,分部收集流出液,可以得到樣品中所含的各單一組分,從而達到分離各組分的目的。

色譜層析分離純化蛋白質有多種方法,包括凝膠過濾色譜,離子交換色譜,親和色譜,疏水色譜高效液相色譜等。其中親和色譜在重組蛋白純化中的應用中最為廣泛。

分離純化原則總結:

  • 應盡可能利用蛋白質不同物理特性選擇所用的分離純化技術,而不是利用相同技術多次純化;
  • 不同的蛋白在性質上有很大區別,每一步純化步驟都應當充分利用目的蛋白和雜質成分物理性質差異;
  • 在純化早期階段要盡量減少處理體積,方便后續純化;
  • 在純化后期階段,再使用造價高的純化方法,有利于純化材料的重復使用,減少再生復雜性。

親和色譜

親和色譜是利用待分離物質和它的特異性配體間具有的特異性親和力,從而達到分離的目的。即將一對能可逆結合和解離生物分子的一方作為配基,與具有大孔徑、親水性的固相載體相偶聯、制成專一的親和吸附劑并填充色譜柱,使得樣品混合物流經色譜柱時,與親和配基能結合的物質就被選擇性地吸附下來,而其他的蛋白質及雜質不被吸附,從色譜柱中流出,使用適當的緩沖液使被分離物質與配基解吸附,即可獲得純化的目的產物。

親和色譜具有高選擇性,高分辨率和高容量的特點,并且親和色譜純化過程簡單,迅速,且分離效率高。并且可用于純化生物大分子、稀溶液的濃縮、不穩定蛋白的貯藏、從純化分子中除去殘余污染物等。但其必須針對某一分離對象,制備專一的配基和尋求穩定色譜的條件,且成本較高。(查看完整親和色譜純化方法介紹

實驗案例(從E.coli 中提取誘導表達的GST 標簽融合蛋白)

案例簡介

谷胱甘肽S-轉移酶(GST)親和標簽是純化重組蛋白的常用方法,該方法以GST 能夠偶聯在介質上的谷胱甘肽配體結合為基礎。同時,帶有GST 的蛋白與配體結合是可逆的,能夠在溫和,非變性的條件下通過加入還原型谷胱甘肽被洗脫下來。

實驗材料

BL21 感受態細胞、PGEX 表達載體、LB 培養基、Amp(氨芐青霉素)、IPTG、蛋白酶抑制劑、緩沖液1(100mmol/L Tris,PH 8.5,500mmol/L NaCl)、緩沖液2(100mmol/L NaAc,PH 4.5,500mmol/L NaCl)、PBS 緩沖液(100mmol/L NaCl,2.7mmol/L KCl,10mmol/L Na2HPO4,1.8mmol/L KH2PO4)、洗脫緩沖液(50mmol/L Tris,PH 8.0,10mmol/L GSH)、微量紫外分光光度計、超聲波破碎儀、高速冷凍離心機、GST 柱

實驗方法

  • 載體構建和細菌培養
    • 采用反轉錄PCR擴增得到目的基因,構建到表達載體(PGEX-4T-1)上;
    • 用構建質粒轉化表達菌BL21,LB 平板37℃;
    • LB 平板上挑取單一菌落接入5mL LB 培養基(100ug/mL Amp)中,37℃培養3~5h;
    • 將5mL 菌液接入1L LB(100ug/mL Amp)液體培養基中,37℃培養至OD60≈0.6,加入0.3mmol/L 的IPTG;
    • 16℃誘導16h;
    • 將培養好的菌液于5000r/min 離心10min,棄去上清液,收集菌體,離心后菌體沉淀懸浮于25mL Binding buffer 中。
  • 細胞破碎和蛋白分離
    • 往懸浮好的菌液中加入適量蛋白抑制劑(10uL 的10mg/mL antipain,10uL 的10mg/mL leupeptin 和1mL的1mol/L PMSF),冰浴放置;
    • 超聲破碎,每個循環26 次,超聲6s,間隔5s,視破碎效果共2~4 個循環,破碎后的菌體4℃ 1800r/min
    • 離心30min,上清保持在4℃;
    • GST 柱先用PBS 緩沖液平衡,上樣結合30~60min,每5~10min 攪拌一次,流干;
    • 用2~3 倍體積PBS 緩沖液平衡清洗非特異性蛋白,流干,加入15mL 洗脫緩沖液洗脫;
    • 由于殘存少量蛋白酶,洗脫出來的目的蛋白溶液可于4℃保存幾小時;
    • SDS-PAGE 檢測初步純化效果,進行下一步純化步驟。
  • 蛋白檢測和GST 柱的恢復
    • 用3 倍柱體積的6mol/L 鹽酸胍處理柱子10min;
    • 用3 倍柱體積的水洗柱2~3 次;
    • 用3 倍柱體積的緩沖液1 處理柱子10min;
    • 用3 倍柱體積的緩沖液2 處理柱子10min;
    • 再次重復3,4 步驟倆次;
    • 用3 倍柱體積的水洗柱2~3 次;
    • 用3 倍柱體積的PBS 緩沖液洗柱2 次;
    • 往柱內加3 倍體積PBS 待用。
  • 問題分析及解決方案
  • GST 標簽蛋白不結合柱子或結合能力非常弱的原因及解決辦法

    原因

    • 過分的機械裂解使標簽蛋白表性,阻止結合;
    • GST 標簽蛋白在樣品中有聚集,導致沉淀;
    • 標簽蛋白濃度過低;
    • 標簽蛋白可能改變了GST 構相;
    • 平衡時間過短。

    解決方法

    • 裂解過程中,采用溫和的裂解條件;
    • 在細胞裂解前的緩沖液中加DTT;
    • 濃縮樣品,結合能力依賴濃度;
    • 可以通過降低結合的溫度來改善結果;
    • 確認至少用5 倍柱體積的PH 6.5~8.0 的緩沖液平衡過。

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