RACE技術

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RACE即cDNA末端快速擴增技術(rapid amplification of cDNA ends),是一種基于逆轉錄PCR從樣本中快速擴增cDNA的5′端及3′端的技術,由Frohman等人于1988年發明。利用RACE可以通過已知的部分cDNA序列來得到完整的cDNA的5′和3′端。RACE的特點是在僅已知單側序列可供設計特異性引物時,應用RACE技術仍能完成擴增,因此RACE技術也成為單側PCR。

RACE原理

RACE包括3′RACE和5′RACE,分別用于cDNA3′端和5′端的擴增。根據已知序列設計特異性引物,利用3′RACE獲得3′端序列(基因特異性引物→3′末端),利用5′RACE獲得5′端序列(基因特異性引物→5′末端),最終獲得完整的cDNA序列。3′RACE與5′RACE原理有所不同,下面分別做一介紹。

3′RACE

RACE的實驗樣本包括總RNA,poly(A)+RNA等。首先根據mRNA3′末端天然存在的Poly(A)尾部設計反轉錄引物逆轉錄獲得第一條cDNA鏈。根據已知的cDNA序列設計基因特異性引物(gene specific primer,GSP)合成第二條cDNA鏈。隨后以基因特異性引物(GSP)及正義鏈3′末端引物作為一對引物,對得到的cDNA鏈進行PCR擴增,從而得到cDNA的3′端序列(基因特異性引物→3′末端)。

3′RACE-PCR原理5′ RACE-PCR原理

圖1:3′RACE擴增流程圖2:5′RACE擴增流程

5′RACE

根據已知的cDNA序列設計基因特異引物(GSP),逆轉錄獲得第一條cDNA鏈,同時用末端脫氧核苷酸轉移酶(TdT)在cDNA3′端加Poly(C)尾。依據Poly(C)尾設計特定引物合成第二條cDNA鏈。隨后以第二條cDNA鏈為模板利用基因特異性引物合成雙鏈cDNA。最后以基因特異性引物(GSP)及反義鏈3′末端引物為一對引物進行PCR擴增獲得cDNA5′端序列(基因特異性引物→5′末端)。

在實際操作中,為了提高結果的特異性實際操作步驟會比上述原理復雜,此處只做原理性講解,具體提高特異性的方法下文會有描述。

RACE的意義

由于某些mRNA模板過程或模板二級結構含量過高,僅利用poly(A)尾來獲得全長cDNA比較困難,甚至無法實現。因為長的mRNA(或二級結構含量過高)的反轉錄過程往往會提前終止,導致合成的cDNA第一鏈不完整,最終產生大量的非特異性產物。同時實驗操作繁瑣,在RACE技術出現之前,獲得mRNA的全長反轉錄物cDNA往往需要數周甚至數月才可以完成。RACE技術為cDNA克隆方法開辟了新紀元,使用RACE技術可在1-2天內獲得cDNA全長序列,同時特異性大大提高。

RACE技術的優點

RACE技術相對于其它克隆全長cDNA的方法(如轉座子標簽技術、圖譜克隆技術、mRNA差異顯示技術等)具有價廉、簡單和快速等特點。用RACE獲得cDNA克隆只需幾天的時間,而且對低豐度的起始反應物質,也能迅速反饋是否有目的產物生成。RACE所使用的起始總RNA或mRNA僅需ng級別,可擴增出豐度低于0.00001%的RNA樣本,甚至僅有幾個RNA分子亦可被檢測出來。

RACE技術的局限性

盡管RACE的方法很有實用價值,但是要成功的應用該技術還是比較困難的,尤其是5′RACE,反轉錄、加尾、PCR這三個連續的酶促反應任一步驟的操作失誤都會引起實驗的失敗,即使酶促反應步驟能順利進行,也有可能會產生大量的非特異性產物。要做好RACE實驗并不容易,實際操作中存在不少困難,需要采取多種措施以提高產物的特異性。

RACE提高特異性方法

傳統RACE技術存在諸多缺點,其特異性低,產物可能是單一產物、多個產物,甚至是不能分辨的連續條帶。為了提高擴增的特異性,需要在傳統RACE技術基礎上進行改進。RACE技術的改進主要涉及引物的設計及PCR技術的改進兩部分。

引物設計的改進

  • 使用鎖定引物(lock docking primer):在oligo(dT)引物的3′端引入兩個簡并的核苷酸MN(結構為5′-oligo(dT)16-30MN-3′,M=A/G/C;N=A/T/C/G)。使用鎖定引物可使引物定位在poly(A)起始位點,消除了在合成第一條cDNA鏈時oligo(dT)與poly(A)尾的任何部位結合所帶來的影響。
  • 3′RACE以3′末端的poly(A)序列設計逆轉錄引物時,使用oligo(dT)和一段接頭序列作為引物(圖1),這樣就在cDNA末端接上了一段特殊的接頭序列,在得到第一條cDNA鏈之后,依據接頭序列設計基因特異性引物,如此則后續的PCR擴增中一對引物均為基因特異性引物,可以有效提高擴增的特異性。
  • 5′RACE在以第一條cDNA鏈3′末端的poly(C)計擴增引物時,使用poly(G)和一段接頭序列作為引物(圖2),在第二條cDNA鏈后接入一段特殊的接頭序列。依據接頭序列設計基因特異性引物,并用此引物與根據已知cDNA序列設計的基因特異性引物作為一對引物進行PCR擴增。

PCR技術的改進

  • 提高反轉錄的溫度:mRNA反轉錄成首鏈cDNA決定了5′RACE的成敗,由于靠近mRNA的5′端GC/AU比率較高,可能形成穩定的二級結構從而導致在反轉錄時產生切短的cDNA片段。這些片段不但可以與完整的cDNA片段進行同樣的加尾反應,而且在后面的PCR中還會被優先擴增,從而產生大量的的非特異性產物。因此,可以采用提高逆轉錄溫度的方式降低反轉錄過程中mRNA二級結構的穩定性。
  • 采用巢式PCR:巢式PCR是指使用兩對或兩對以上的引物進行DNA擴增的技術,即先設計一對特異性引物(GSP1、GSP2)進行第一輪擴增,隨后使用在第一對引物內部的第二對特異性基因(GSP3、GSP4)進行第二輪擴增(根據需要也可設計第三對引物GSP5、GSP6,進行第三輪擴增)。利用巢式PCR可提高PCR擴增的特異性。

常見的RACE技術

隨著分子生物學技術的發展,科學家結合其它的分子生物學技術對最初的RACE技術進行了改進,從而豐富了RACR技術的類型。目前使用的RACE技術包括:經典RACE、Adapter-Ligated RACE、RLM-RACE、Cap-switching RACE和環形RACE等等。

Adapter-Ligated RACE

Adapter-Ligated RACE是Adapter-Ligated PCR技術與RACE技術的結合。利用T4連接酶將接頭與cDNA兩末端連接,在PCR循環的退火步驟中,由于短cDNA退火溫度低,兩端接頭容易發生退火,形成鍋柄狀結構,兩端接頭結合阻止引物與模板結合,終止PCR反應。長cDNA的退火溫度高,不易形成鍋柄結構,因此引物可以與接頭結合,實現延伸。Adapter-Ligated RACE可以讓長片段cDNA的克隆在擴增反應中占主導,從而盡可能多地得到目的基因的序列信息。

RLM-RACE

利用斷裂的mRNA5′端沒有帽子結構的特點,事先加入牛小腸堿性磷酸酶(CAP)將斷裂mRNA5′末端暴露的磷酸基團切除。再加入煙草酸焦磷酸酶(TAP),TAP具有切除mRNA帽子結構的催化活性,能夠使mRNA5′端暴露一個磷酸基團,接著在T4連接酶的催化下將銜接頭與經過活化的mRNA5′端鏈接。經過鈍化的mRNA是不能與銜接頭鏈接的。經過這樣處理后,便可以擴增目的mRNA5′端片段。

Cap-switching RACE

第一步以poly(T)作為引物對mRNA3′端克隆。當新和成cDNA延伸到mRNA5′帽子結構時,加入莫洛尼鼠白血病病毒逆轉錄酶(MMLV)在cDNA3′端加入若干胞嘧啶poly(C)。MMLV所催化的加尾反應需要依賴模板和帽子結構的存在,因此只有完整的cDNA末端才會加上胞嘧啶殘基,接著加入特異性引物,該引物在3′末端含有含有多聚鳥嘌呤核苷酸poly(G)可與cDNA末端新添加的多聚胞嘧啶核苷酸poly(C)退火,在DNA聚合酶的催化下以新添加的引物為模板實現接頭轉化,從而向cDNA3′端引入特異性序列,最后再進行PCR。

環形RACE

環形RAC利用poly(T)引物進行逆轉錄PCR反應擴增第一條cDNA。經RNaseH降解模板后加入T4鏈接酶,加入T4連接酶時會發生環化反應或串聯反應。無論是環化反應或是串聯反應的產物都可以根據已知序列設計新引物來補充第二條鏈。環狀分子或串聯分子產生第二條cDNA鏈后,在未知區域的兩側設計一對引物將未知區域置換到已知序列中間,進行普通PCR。

需要說明的是,RACE技術種類繁多,但目前沒有任何一種RACE技術能完美地擴增多有類型的RNA,每一種RACE技術都有其適合擴增的RNA種類,比如經典RACE適合擴增有poly(A)尾結構的RNA,Cap-switching RACE技術適合于擴增具有5′端帽子結構的RNA。

RACE與抗體測序

將RACE擴增得到的cDNA片段克隆至載體中,使用儀器對克隆后的質粒進行測序,最終得到該cDNA的序列。德泰生物提供雜交瘤細胞測序服務,可對抗體的可變區、重鏈、輕鏈及全長進行測序。

更多閱讀

熒光定量PCR
降落PCR

參考文獻

[1]. 徐燁,劉雅婷等.幾種主要的RACE技術及應用[J].中國農業科技導報,2012,14(2):81-78;

[2]. 鄧雪柯,殷建華等.3中5′RACE技術的比較與優化[J].成都醫學院院報,2007,2,1:20-23;

[3]. 陳啟龍.RACE技術的研究進展及其應用[J].2006,6,3:95-98;

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