瓊脂糖凝膠電泳原理/實驗步驟/特點/相關FAQ

本文主要介紹了瓊脂糖凝膠電泳的原理及實驗操作步驟,及電泳后DNA的回收方法;瓊脂糖凝膠的特點及電泳實驗相關試劑的配置及瓊脂糖凝膠電泳常見問題分析。
下載

瓊脂糖凝膠電泳樣品制備

大腸桿菌質粒DNA模板提取:

1、接1%含質粒的大腸桿菌細胞于2ml?LB培養基

2、37℃振蕩培養過夜

3、取100ul菌體于2mlEp管中,4000rpm離心3min,棄上清

4、加100ul溶液A(1%葡萄糖50mM/L?EDTA?pH8.0,25mM/L?Tris-HCl?pH8.0)充分混合

5、加入200ul溶液?B(0.2?mM/L?NaOH,1%?SDS),輕輕翻轉混勻,置于冰浴5?min

6、加入150ul預冷溶液C(5?mol/L?KAc,pH4.8),輕輕翻轉混勻,置于冰浴5?min

7、10000rpm離心20min,取上清

8、加入等體積的異戊醇,混勻后于60℃靜置10min

9、再次10000rpm離心20min,棄上清

10、用500ul70%的乙醇洗滌,抽干所有液體

11、待沉淀干燥,溶于5ul的TE緩沖液中(通常可獲得3-5ug的DNA)

真核細胞DNA模板提取:

真核細胞DNA的提取是進行功能和結構研究的重要一步,真核DNA提取要保證DNA的完整性(不斷裂)。真核DNA可以從培養的細胞新鮮的組織中提取。通常都是采用蛋白酶消化后用酚抽提獲得。不同來源的材料進行不同的預處理,但是后續提取DNA的方法是類似的,提取的原則就是,盡量減少對DNA的破壞或降解,保持其完整性。具體提取步驟如下:

(一)材料預處理:

培養細胞用緩沖液洗滌后離心(4000rpm/5min)去除上清,得到細胞沉淀物加入10倍體積的裂解緩沖液,55℃水浴1-2小時;

組織(組織要剪碎勻漿)加入1.5ml到離心管中,加入20%的SDS?25ul,蛋白酶K(2mg/ml)25ul,然后混勻,60℃水浴1-3小時;

(二)DNA的提取(適用于處理后的細胞或組織)

  1. 預處理的樣品加入飽和酚,輕輕混勻幾分鐘后離心(5000rpm/10min),去上層水相;
  2. 加入等體積的飽和酚,混勻,再次離心,去上層水相;直至去上層水相變得澄清,不然可重復此操作;
  3. 加入十分之一的3M錯酸鈉(pH2.5)HE?2.5倍體積的無水乙醇,輕輕混勻;
  4. 出現絮狀物后離心(5000rpm/10min),棄上清;用75%乙醇洗滌沉淀,再次離心,棄上清;
  5. 室溫下晾干(待乙醇揮發),加入100ul?TE溶解即可。

提取DNA的物品需要高壓滅菌,以防止帶入其他核酸污染;試劑同樣高壓滅菌;

PCR擴增

PCR擴增實驗步驟詳見:PCR標準操作流程

瓊脂糖凝膠電泳原理

瓊脂糖凝膠電泳,是以瓊脂糖為介質,對不同大小的DNA或RNA實現分離的一種電泳方法。瓊脂糖是一種多糖,具有親水性,但是不帶電荷。使得DNA在堿性條件下使其帶負電荷(pH8.0的緩沖液),在電流作用下,以瓊脂糖凝膠為介質,由負極向正極移動,根據不同的DNA分子片段的大小和形狀不同,在電場中泳動的速率也不相同,同時在樣品中加入染料(如EB或花青素類染料)能夠和DNA分子間形成絡合物,經過紫外照射,可以看到DNA的位置(比對marker可知分子量大小),從而達到分離、鑒定的目的。如圖1為瓊脂糖凝膠電泳原理。瓊脂糖凝膠電泳原理

圖1:瓊脂糖凝膠電泳原理

瓊脂糖凝膠電泳優點

  1. 瓊脂糖凝膠是具有大量微小孔道的基質,其孔徑尺寸取決于它的濃度。0.075瓊脂糖的孔徑為800nm,0.16的孔徑為500nm,1%的瓊脂糖孔徑為150nm,這都是常用的瓊脂糖凝膠的濃度,可以分離0.1-60kb左右的DNA,大孔性有利于免疫固定、免疫電泳和微量制備;
  2. 瓊脂糖具有較高機械強度,允許在1%或更低的濃度下使用;且與別的生物只存在微弱的結合;
  3. 瓊脂糖無毒,瓊脂糖膠凝固過程不會發生自由基聚合,無需催化劑;
  4. 瓊脂糖膠具有熱可逆性,低熔點易于回收樣品,可用于對溫度敏感材料的制備;
  5. 易于保存,是高靈敏放射自顯影的理想材料。

瓊脂糖凝膠電泳步驟

瓊脂糖凝膠電泳儀器

圖2:瓊脂糖凝膠電泳儀器

  1. 用蒸餾水將制膠工具洗干凈,準備好制膠平板,用瓊脂將模具邊緣封閉,架好梳子;
  2. 根據要分離的樣品(DNA)大小配制合適濃度的瓊脂糖凝膠。準確的稱取一定量的瓊脂糖干粉,加入到合適體積的錐形瓶中,加入一定量的電泳緩沖液(30ml左右TAE);放入到微波爐內加熱融化,冷卻片刻(不燙手即可);
  3. 融化后的瓊脂溶液搖晃混勻,倒入電泳槽中,等其凝固;
  4. 室溫下凝固30-40min左右,小心的拔出梳子,取出凝固好的凝膠放入電泳槽內,準備上樣;
  5. 在電泳槽中倒入電泳緩沖液(TAE);沒過膠面1mm左右,去除膠孔內的氣泡;
  6. 上樣,5ulDNA樣品加入1ul上樣緩沖液(loading?buffer)和1ul的染料,用搶混勻后加入到凝膠孔內;
  7. 上樣結束,接通電源,紅色正極,黑色負極,DNA樣品有負極往正極運動,加樣孔側為負,,40-50v電壓,電壓30敏左右即可(<40min);
  8. 電壓結束,關閉電源,凝膠成像儀上觀察電壓位置并比對marker判斷大小。

瓊脂糖凝膠配制濃度與DNA的最佳分離范圍

瓊脂糖濃度/% 0.3 0.6 0.7 0.9 1.2 1.5 2.0
DNA大小/kb 5-60 1-20 0.8-10 0.5-7 0.4-6 0.2-4 0.1-3

瓊脂糖凝膠電泳相關試劑配置

(一)50?x?TAE?buffer(pH8.5)
在1L燒杯中準確稱取Tris?242g,EDTA(Na)37.2g,加入800ml的去離子水,充分攪拌溶解,加入57.1ml的乙酸,充分攪拌,調pH8.5后,定容至1L。每次使用加水稀釋50倍即1xTAE?buffer。
(二)10?x?TBE?buffer(pH8.3)
在1L燒杯中準確稱取Tris?108g,EDTA?7.44g,硼酸55g,加入800ml的去離子水,充分攪拌,調pH8.3后,定容至1L。
(三)6?x?loading?buffer
在500ml燒杯中,準確稱取EDTA?4.4g,二甲苯青FF250mg、溴酚藍(Bromophenol?Blue)250mg,加入200ml去離子水,加熱至充分溶解;在加入180ml甘油,條pH為7.0,用去離子水定容至500ml,常溫保存。

瓊脂糖凝膠電泳結束DNA的回收

對一些電泳結束的DNA進行回收,用于亞克隆或者探針標記。常用的方法有低熔點瓊脂糖法,壓碎法。或使用目前較為方便的試劑盒回收。下面介紹凍融法回收DNA片段。

  1. 切膠(無核酸污染的干凈刀片切):電泳結束后,切下對應片段大小的瓊脂糖凝膠,置于1.5ml的離心管中;
  2. 加入等體積的Tris-HCl飽和酚(pH7.6),振蕩混勻,在-20℃放置10min;
  3. 低溫離心(10000rpm/5min),將離心上層轉移至新的離心管中;
  4. 在含膠的離心管中加入一半體積的水,振蕩混勻,在-20℃放置10min;
  5. 低溫離心(10000rpm/5min),合并上清液;
  6. 用等體積的酚和氯仿分別抽提一次,獲得上清;加入十分之一體積3M?NaAc(pH5.2)和2.5倍體積預冷的無水乙醇,混勻;在-20℃放置30min;
  7. 低溫離心(13000rpm/10min),棄上清,75%乙醇洗沉淀2次,待乙醇揮發后加入水或者TE溶解即可。

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