親和純化常見問題分析解決

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1. 通過 His 標簽純化的蛋白,雜帶比較多,如何改進?

(1)如果純化的是上清,蛋白酶會部分降解目的蛋白,可通過加多種蛋白酶抑制劑改進。

(2)可提高雜蛋白與鎳柱結合起始咪唑濃度,以降低雜蛋白與鎳柱的親和力。

(3)雜蛋白和目的蛋白結合,可通過超聲前加入去垢劑的方式消除(1%-2%Tritonx-100)。

2. 鎳柱使用中出現棕色是怎么回事?

出現這樣的情況,主要是緩沖液中 DTT 的影響, DTT 會對鎳柱的顏色和純化效率有很大的影響,在堿性的緩沖液條件下鎳離子會被 DTT 還原生成

棕色的沉淀,所以所有鎳柱的生產商都強調要盡量避免 DTT 的參與(一般的鎳柱耐受小于 5mM DTT,推薦緩沖液中不要超過2mM DTT)。
3. 鎳柱堵了怎么辦?

(1)柱子發生堵塞,可能是樣品中細胞碎片或其他雜顆粒所致,所以樣品一定要高速離心。

(2)上清純化時,蛋白發生變性,有絮狀物產生,趕緊加入 1-2mM DTT (上清樣品處理要在冰浴中進行),還不行加尿素變性,使其在變形環境下。

(3)樣品處理時的料液比不要太小,否則黏度大,或者導致蛋白析出或變性,料液比要在1/10-1/15 之間較適宜。
4.?純化過程中,蛋白出現了渾濁,怎么辦?

(1)出現渾濁,說明蛋白處在不穩定的環境中或者自身就不穩定,所以要檢查緩沖體系是否正確,環境是否低溫,或在緩沖液中加入還原劑 DTT。

(2)加入肌氨酸鈉,迅速使蛋白變性,消除渾濁現象。

5.?沒能純化到帶 His 標簽的蛋白,蛋白都流穿了(未掛柱)?

(1)超聲的功率不對(太大,蛋白炭化,太小,蛋白沒有釋放) ;

  • ?策略:改變超聲功率,并在超聲前加入溶菌酶。

(2)樣品或者是結合緩沖液不正確 ;

  • 策略:檢測 pH 及樣品和結合緩沖液的組成份(EDTA)。

(3)組氨酸的標簽沒有完全的暴露 ;

  • ?策略:在變性條件下(用 8M 脲,6M 鹽酸胍,1%SDS) 并加入 1-2mMDTT 進行純化。

(4)His 標簽丟失;

  • 策略 1:WB 或者 anti-his 的抗體檢查 His 是否表達,上游構建,改變his-tag 的位(C-terminal or N-terminal),必要時增加 his 個數(常用 6-10 個);
  • 策略 2:孵育的時間不夠,降低流速和增加孵育的時間;
  • 策略 3:改變螯合的金屬離子,尋找到最佳的結合金屬離子。

Ni2+通常是從宿主細胞蛋白中純化大多數(組氨酸)6 標記的重組蛋白質的首選金屬離子,也是一般最常用的離子。蛋白和金屬離子之間的結合強度受幾種因素影響,包括長度、位置、親和標記在蛋白的暴露程度、所用離子的類型、以及緩沖液的 pH,因此一些蛋白用其他離子可能更容易地進行純化而不用 Ni2+。可以利用 Hitrap IMACHP 來篩選不同的金屬離子。

6.?蛋白掛在柱子上洗脫不下來,怎么解決?

(1)洗脫條件太溫和(組氨酸標記的蛋白質仍然結合在柱上,結合力較強) 策略:用增加咪唑的梯度洗脫或降低 pH 來找出最佳的洗脫條件。

(2)降低 PH 的方法洗脫的,因 為若 PH 低于 3.5,會導致鎳離子脫落 策略:改變洗脫辦法,咪唑競爭性洗脫

(3)蛋白已沉淀在柱上 策略:減少上樣量和孵育的時間,試用去污劑(1%-2%Tritonx-100)或改變 NaCl 的濃度,或在變性條件下洗脫(用 8M 脲,或 6M 鹽酸胍),最終也可在洗脫 Buffer中加入 2mMDTT 或者 0.5%肌氨酸鈉進行洗脫。

(4)非特異性疏水或其他相互反應 策略:加非離子去污劑到洗脫緩沖液(如,2%Triton X-100)或增加 NaCl 的濃度。

7.?如何處理樣品,可使其初步提純(如何洗去蛋白的自身帶)?

(1)上清樣品處理,要加入去污劑,蛋白酶抑制劑,還原劑,還要注意溫度及超聲破碎的參數。

(2)去大腸桿菌自身帶(兩條 30KD-40KD)可用非變性緩沖液超聲懸浮(加入去垢劑),離心 6000r/min,30min,10℃。(若效果不夠可繼續上述步驟)。

(3)大腸桿菌包涵體的洗滌,可用包涵體洗液多洗幾遍,也可用 1M/2M/4M/8M 尿素逐步溶解,可選取其中純度最佳的。

(4)可用硫酸銨沉淀法,初步提純。

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