蛋白質芯片技術檢測蛋白質間相互作用

下載

傳統的相互作用分析方法(如GST-pull down免疫共沉淀酵母雙雜交技術等)在大規模研究蛋白相互作用方面有著一定的局限性。隨著生物芯片技術的發展,蛋白質芯片技術被應用于蛋白間相互作用研究。蛋白質芯片技術能夠快速、高通量的進行蛋白質相互作用的研究。

產生背景

蛋白質芯片技術的產生得益于生物芯片技術的發展。1991年美國Affymetrix公司成功研制了世界上第一塊DNA芯片,從此拉開了研究生物芯片技術的帷幕。DNA芯片可以應用于對生物樣品中的各種已知/未知核酸序列的表達進行檢測和比較,但DNA芯片在對蛋白質功能結構的研究方面有很大的限制。為了進一步對蛋白質的功能與結構進行研究,蛋白芯片技術應運而生。

實驗原理

蛋白質芯片又稱蛋白質陣列或蛋白質微陣列,是一種體外檢測相互作用的方法。其基本原理是以蛋白質分子作為配基(探針蛋白),將其有序地固定在固相載體(滴定板、濾膜、玻璃片等)的表面形成微陣列;用帶有熒光標記的蛋白質(或其它分子)與之作用,經漂洗將未結合的成分洗去,經熒光掃描等監測方式測定芯片上各點的熒光強度。通過熒光強度分析蛋白質與蛋白質之間相互作用的關系,由此達到測定各種蛋白質功能的目的。
蛋白芯片技術原理
圖1:蛋白芯片技術原理

蛋白質芯片檢測蛋白相互作用操作流程

蛋白質芯片制備

蛋白芯片上的蛋白根據研究目的的不同,可以選用抗體、抗原、受體、酶等具有生物活性的蛋白質,利用原位制備或制備后交聯等方法,將不同的探針蛋白質,按設計好的序列固化于固相載體。蛋白芯片制備的關鍵是制備時注意維持蛋白質的天然構象(防止蛋白變性,維持原有特定的生物學活性)。

樣品預處理

蛋白質芯片的探針蛋白特異性高、親和力強,受其它雜質的影響低,因此對生物樣品的要求較低,只需對少量樣本進行沉降分離和標記后,即可加于芯片上進行分析和檢測。甚至可以直接利用生物材料(血樣、尿液、細胞及組織等)進行分析。

共孵育與檢測

目前主流蛋白質芯片的信號檢測方式主要是熒光檢測形體系。將蛋白質芯片與熒光素標記的生物靶分子(核酸或蛋白質等)進行雜交,洗脫未結合組分后通過共聚焦熒光掃描儀或CCD熒光成像儀在特定的波長下激發熒光,獲得反應結合的信號。

數據分析

對熒光標記的芯片用共聚焦熒光顯微鏡進行掃描,然后通過計算機分析出每個點的平均熒光密度。
在每個芯片的制作過程中應設計有陰陽性對照反應,或已在多次實驗中找到一個判斷陰陽性結果的界值,作為判斷結果的根據。將每個點的熒光密度或灰度除去背景干擾后與相對界值進行比較,根據信號的有無、多少進行定性或定量分析。當然,在結果分析過程中需要對大量數據進行復雜處理,這些都需要通過特定的計算機軟件來完成。

蛋白質芯片優點

  • 微量化:所需樣品量極少
  • 高通量:可以實現成千上萬個蛋白質的平行分析
  • 蛋白芯片使用相對簡單,結果正確率較高
  • 樣品要求低,可直接對不經處理的各種體液和分泌物進行檢測

存在問題

  • 成本過高,需一系列昂貴的尖端儀器
  • 芯片的標準化問題

蛋白質芯片技術應用

利用蛋白質芯片技術可以檢測蛋白-蛋白、蛋白-小分子、蛋白-DNA、蛋白-抗體、蛋白-脂類之間的相互作用。
蛋白質芯片技術應用

圖2:蛋白質芯片技術應用

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