蛋白質濃縮技術介紹及操作簡介

簡介

蛋白質在制備過程中,由于蛋白分離純化過程而使得樣品變得很稀,澄清后的蛋白質溶液常常需要進行濃縮,以提高蛋白質濃度,減少樣品體積,這樣有利于隨后進一步進行蛋白質色譜純化。

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濃縮技術分類

常用的濃縮方法有吸附法、超濾法、沉淀法、透析干燥法等。每種方法都有自己的優缺點,比如吸附法選擇性比較差,不能連續操作,濃縮倍數低;超濾法成本低,操作方便,條件溫和,能較好的保持生物大分子活性,回收率高等;沉淀作用對樣品中的蛋白質濃度要在100mg/L以上,并且由于相變導致收率較低;透析法濃縮需要比較長的時間,體積也受到一定限制;冷凍干燥所需時間長,收率低且在濃縮蛋白的同時也濃縮了鹽。

吸附法

吸附法是指通過吸附劑直接吸收除去溶液中水分子使之濃縮。所用的吸附劑必須與溶液不起化學反應,對蛋白不吸附,易于溶液分開。吸附法是最簡單快速的濃縮蛋白質溶液的方法,所需儀器簡單,適用于穩定性較差的蛋白質。常用的吸附法主要有透析袋濃縮和凝膠濃縮。

超濾法

超濾法是使用一種特殊的薄膜,能夠對溶液中各種溶質分子進行選擇性過濾。液體在一定壓力作用下通過膜時,溶劑和小分子透過,大分子受阻保留。該方法最適于生物大分子尤其是蛋白質的濃縮或脫鹽。應用超濾法的關鍵在于膜的選擇,水的流速,分子量和截止值等。

沉淀法

沉淀法是早期的蛋白純化分離方法,但現在只用于蛋白質的初步分離,然后采用色譜法進一步純化。蛋白質分子在水溶液中離子集團相互作用,通過改變PH值或離子強度,加入有機溶劑或多聚物,可以促進蛋白質分子凝聚,形成蛋白質沉淀,再通過離心或過濾可以獲得沉淀物,然后利用合適的緩沖液清洗,溶解沉淀物,再經過透析或凝膠過濾,除去殘留的溶劑成分。

濃縮操作實驗方法

透析袋濃縮

材料:

50%乙醇
10mmol/L EDTA,PH 8.0
0.05mmol/L NaHCO3
1g/L 疊氮鈉
蛋白質溶液
透析袋
透析袋夾

方法:

  1. 選擇合適MWCO的透析袋,剪下需要長度的干透析袋,只能用無粉手套觸摸透析袋;
  2. 用透析夾關閉透析袋的一端,把蛋白樣品加入透析袋中,再關閉另一端,在透析袋里留下一定的空間,并檢查每一端樣品有無滲漏;
  3. 將裝好樣品的透析袋放入裝有透析袋放入裝有透析緩沖液的燒杯中,確信透析袋被完全浸沒,然后把燒杯放在磁力攪拌器上攪拌,整個裝置放在有適當溫度(通常為4℃,以增加蛋白質穩定性)的環境中;
  4. 可以通過測定透析緩沖液緩沖液的電導來檢測,當透析液的電導增加慢下來時,就更換緩沖液,直到在經過1~2h的攪拌后電導基本保持不變為止,如果沒有電導儀,至少再換一次緩沖液,間隔時間為4~6h,若樣品體積較大或透析袋大于20mm,間隔時間可為8~12h;
  5. 從緩沖液中取出透析袋,用蒸餾水沖洗,除去夾子后將透析過的樣品小心倒入容器內;
  6. 通過比較透析樣品和未用過的透析緩沖液的電導值,證實達到所希望的鹽濃度。

如何處理新的透析袋

將減下的新的透析袋浸入蒸餾水中,用手指捏住透析袋將倆層分開,先用50%乙醇徹底沖洗透析袋里外側(如果是蛋白方面的工作,建議不要煮透析袋,為了更徹底地除去甘油和硫,可以將透析袋浸入到50%的乙醇中),然后在一個1L的燒杯中混合400mL 10mmol/L EDTA(PH 8.0)和400mL 0.05mmol/L NaHCO3,將透析袋移入燒杯中,用磁力攪拌器攪拌30min;用800mL水替換溶液,攪拌10min,重復一次,將透析袋移入新蒸餾水中。透析袋用完之后,4℃保存于含0.1%疊氮化鈉的水中,任何時候都不要讓透析袋變干。

超濾濃縮

濃縮樣品

  1. 要濃縮的樣品含鹽量必須0.3M以上,含鹽量低的樣品須補加到0.3MNaCl;
  2. 在內管(附有3KD膜)中加入500μl樣品,將內管套入外管;
  3. 對稱放置離心管,14520rpm(即14000g)離心。(離心5min約濃縮2倍,10min約4倍,15min約6倍,20min約8倍,30min約10倍);
  4. 離心結束后,將內管倒置套在另一個干凈的離心管呢,3880rpm離心min收集濃縮后的樣品。或者用移液器直接吸出內管中的樣品。

濃縮管使用后的處理和保存

  1. 使用完的濃縮管,立即加入500μl含1MNaCl的緩沖液(此緩沖液與濃縮樣品的緩沖液一致),8000rpm離心20min;
  2. 甩凈內管中的鹽溶液,將內管放入超純水中浸泡1h;
  3. 內管加入超純水500μl,8000rpm離心5min;
  4. 甩凈內管中的水,加入500μl0.2MNaOH,8000rpm離心20min;
  5. 甩凈內管中的NaOH溶液,用超純水再8000rpm離心5min;
  6. 甩凈內管中的水,放入含0.2-0.5‰NaN3的生理鹽水中;
  7. 外管用自來水洗凈后,用超純水沖洗干凈,晾干。

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