噬菌粒和輔助噬菌體

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噬菌粒結構

噬菌粒是一種對絲狀噬菌體進行人工改造得到特殊類型的載體,兼具了絲狀噬菌體與質粒的優點,由單鏈噬菌體包裝序列、復制子以及質粒復制子、克隆位點、標記基因等部分組成。噬菌粒具有基因組較小可插入較大片段、復制型為雙鏈DNA易于操作、轉化效率高、產生的重組子更加穩定等優點。
噬菌粒結構

圖1:噬菌粒結構

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噬菌粒的原件及其特點

衣殼蛋白

絲狀噬菌體有pⅢ、pⅧ、pⅥ、pⅨ五種衣殼蛋白,這五種蛋白都可以用來進行多肽的展示,但最常用的是pⅢ和pⅧ蛋白。

啟動子

啟動子是表達載體的核心元件,噬菌粒載體最常用的啟動子有乳糖啟動子、阿拉伯糖啟動子、堿性磷酸酶啟動子和T7啟動子。

信號肽

噬菌粒載體信號肽通常選擇Sec-識別信號或SRP-識別信號肽。研究表明,Sec-識別信號肽適合展示分泌蛋白,如抗體;SRP-識別信號肽適合轉運折疊比較迅速的蛋白,如錨定蛋白。

基因間隔區(IG region)

基因間隔是DNA的一個片段,不屬于編碼區。在噬菌粒進入宿主細胞質后,IG區的單鏈DNA復制起始位點(噬菌體ori區域)會被PⅡ蛋白識別進而引發單鏈DNA的生成。

噬菌粒生命周期

噬菌粒作為一種特殊的質粒,可以像一般的質粒那樣被復制,也可以在病毒體內作為單鏈DNA被包裝。

噬菌粒的生命周期通常為:將外源基因以雙鏈形式定向整合至噬菌粒,然后通過化學轉化或電轉等方式轉入宿主細胞。由于噬菌粒中除了PⅢ蛋白基因以及欲在噬菌體上展示的外源基因外,沒有任何噬菌體功能基因,導致噬菌粒不能獨立合成單鏈DNA,因此,需要在輔助噬菌體的幫助下才可以完成對宿主細胞的侵染。

在沒有輔助噬菌體超染時,噬菌粒像質粒一樣進行擴增;宿主經輔助噬菌體超感染后,在輔助噬菌體的作用下,噬菌粒IG區的正鏈復制起始位點產生ssDNA,隨后噬菌粒的ssDNA與pⅠ、pⅣ、pⅪ和宿主細胞的硫氧還原蛋白完成復雜的組裝過程,含有噬菌粒基因組的噬菌體成熟。成熟的噬菌體由細胞質釋放到外部環境中。至此噬菌粒的生命周期完成。

輔助噬菌體

輔助噬菌體是一種自身DNA復制效率極低的絲狀噬菌體突變型。其基因組具有M13噬菌體的所有功能基因,但IG區是缺陷的,不能被pⅡ蛋白識別,因而輔助噬菌體本身DNA不能進行單鏈復制。輔助噬菌體能為噬菌粒提供pⅡ蛋白和包裝蛋白,在輔助噬菌體的幫助下,噬菌粒可以順利的進行DNA的復制與噬菌體的包裝,完成對宿主的侵染(這一過程通常稱為超染)。常用的輔助噬菌體有VCSM13和M13K07等。

輔助噬菌體的工作原理為:當含有重組基因的噬菌粒轉染至大腸桿菌后,再用輔助噬菌體進行超染,輔助噬菌體合成的pⅡ蛋白就會優先識別噬菌粒上的正常基因間隔區(IG region),啟動滾環復制,產生ssDNA,這樣所產生的子代噬菌體外殼蛋白所包裝的ssDNA主要是來自含有重組基因組的噬菌粒的DNA,并同時展示噬菌粒編碼的pⅢ或pⅧ與外源肽段的融合蛋白和輔助噬菌體編碼的野生型pⅢ或pⅧ蛋白,確保重組噬菌體能正常感染組裝和增值。
輔助噬菌體工作原理

圖2:輔助噬菌體原理解析

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