噬菌體展示文庫的構建與篩選

噬菌體展示技術是一種用于識別蛋白質和其他大分子配體的體外篩選技術。下載由Simth于1985年建立。其原理是將外源多肽或蛋白質的DNA序列插入到噬菌體外殼蛋白的一個結構基因的適當位置上,在閱讀框正常且不影響外殼蛋白正常功能的情況下,使外源基因隨著外殼蛋白的表達而表達,最終多肽或蛋白以與外殼蛋白融合的形式展示在噬菌體表面。被展示的蛋白或者多肽可以保持相對的空間結構和生物活性,可以利用靶蛋白對其進行篩選。

高親和力抗體篩選

噬菌體抗體庫構建

利用噬菌體展示技術進行高親和力抗體的篩選,需要先構建抗體庫,然后再對噬菌體文庫進行篩選。將外源基因插入噬菌體基因適當位置,隨著噬菌體的傳代,外源蛋白展現在子代噬菌體的表面。所有展示不同外源基因的噬菌體的集合,即噬菌體展示文庫。

用于構建文庫的不同序列的核酸片段有人工合成法、cDNA法、DNase I隨機水解DNA等方法獲得。用于構建文庫的噬菌體展示系統有單鏈絲狀噬菌體展示系統、λ噬菌體展示系統、T4噬菌體展示系統及T7噬菌體展示系統等。
利用cDNA法獲得基因片段并進行噬菌體展示文庫構建的操作流程為提取mRNA ;逆轉錄得到cDNA ;設計合適引物,以cDNA為模板,PCR得到基因序列;將基因克隆至噬菌體載體中;電轉感受態細胞,輔助噬菌體超染;收集上清,上清即為噬菌體展示文庫。

噬菌體展示文庫構建流程

圖1:噬菌體展示文庫構建流程

噬菌體抗體庫的篩選

篩選的方法主要分為體內篩選和體外篩選兩種。體內篩選是指將噬菌體展示文庫靜脈注射到動物體內,因為血管分子內皮的異質性,噬菌體可以有選擇性的導向不同組織,這樣就可以得到與不同組織特異結合的噬菌體展示抗體;體外篩選的方法有生物淘洗法、競爭法、消減法、選擇性感染篩選、延遲性感染篩選等方法。其中生物淘洗法最為常用。本文主要對生物淘洗法篩選噬菌體抗體庫進行說明。

生物淘洗法:以靶蛋白為固定相,以噬菌體展示文庫為流動相,經過一段時間的共同孵育后,洗去未結合的游離噬菌體,然后以競爭受體或酸洗脫下與靶分子結合吸附的噬菌體,洗脫的噬菌體感染宿主細胞后經繁殖擴增,進行下一輪洗脫,經過3輪~5輪的“吸附-洗脫-擴增”后,即可得到與靶蛋白具有高親和性的抗體。

噬菌體展示技術篩選流程

圖2:噬菌體展示技術篩選流程

經過篩選后,對篩選得到的蛋白進一步用酶聯免疫吸附測定或免疫印跡法對其進行特異性篩選,獲取目的克隆或鋪盤進行單克隆分離繼而進行大規模生產。

相關閱讀

噬菌粒與噬菌粒載體
PCR技術

僅供科研

聯系我們

電話:(025)5889-4959

咨詢:[email protected]

地址:南京市高新開發區星火路10號

蘇ICP備14041760號

幸运农场三连中