PCR模板的制備

下載

PCR模板制備是PCR實驗的首要步驟,模板制備是從待分析樣本中純化和濃縮核酸(DNA或RNA)以作為PCR擴增模板的過程。由于PCR用途多樣,用于提取核酸的材料可能是全血、動植物組織、培養細胞、口腔涂片、體液、甚至是1700萬年前到2000萬年前的木蘭葉化石。對于不同類型的樣本,需要利用不同的方法進行核酸提取。下面分別就PCR模板制備的步驟及不同材料的模板制備方法做一介紹

模板制備步驟

模板制備步驟

PCR模板制備指的是從樣本中提取核酸的過程,涉及到裂解細胞、蛋白變性、酚-氯仿抽提、乙醇沉淀等步驟,下面分別就這些步驟做一介紹。

裂解細胞

裂解細胞的方法有以下幾種:

  • 物理破壁法:超聲波處理、研磨法、玻璃珠法等,適用于帶細胞壁細胞的裂解,破碎時需液氮冷凍處理增加細胞壁脆性,細胞破碎后需快速加入TE緩沖液并迅速混勻,對細胞溶漿中DNA進行保護。
    (TE緩沖液成分:10mM Tris-HCL,1mM EDTA PH8.0,Tris-HCL的作用為提供一個緩沖環境,防止 核酸被破壞、EDTA的作用為螯合Mg2+或Mn2+離子,抑制DNase活性;)
  • 化學試劑:SDS、TRIzol(主要用于提取RNA)等。SDS可以促使細胞壁破裂,同時破壞細胞膜結構;TRIzol主要成分是苯酚和異硫氰酸胍,能迅速破碎細胞并抑制細胞釋放出的核酸酶。
  • 酶解法:溶酶菌、蛋白酶K、蝸牛酶等。蛋白酶K適用所有標本的消化處理,蝸牛酶常用于酶解真菌,溶酶菌可以對細菌進行裂解。
  • 煮沸法:通過煮沸進行細胞的裂解,適用于質粒DNA的提取。
  • 微波法:通過微波加熱使細胞裂解,可以用于真菌基因組DNA的提取。

蛋白變性

蛋白變性的目的為使核酸與蛋白質之間的結合鍵斷裂,便于后續去除蛋白質。可以利用SDS等去污劑使蛋白變性,也可利用煮沸的方法使蛋白變性。另外,在苯酚-氯仿抽提的步驟中,苯酚也可以使蛋白變性。

苯酚-氯仿抽提

質粒抽提

苯酚-氯仿抽提的目的為去除細胞裂解液中蛋白、多糖、酚類等雜質,分離核酸。使用苯酚-氯仿溶液處理裂解后的勻漿液,最終核酸分子溶于上層的水相,多糖、酚類等處于下層的有機相,蛋白質則沉淀于兩相之間。

在苯酚-氯仿溶液中苯酚的作用是使蛋白變性,同時抑制DNase的降解作用;氯仿是分子量比較大的有機溶劑,使用氯仿作為有機相可以達到快速的和無機相分離的效果。在用苯酚-氯仿抽提核酸時,通常要加入少許異戊醇(苯酚:氯仿:異戊醇=25:24:1),異戊醇可以減少蛋白質變性操作過程中產生的氣泡,另外,異戊醇有助于分相,使離心后的上層含DNA的水相、中間變性蛋白相及下層有機相溶劑維持穩定。

乙醇沉淀

核酸具有不溶于無水乙醇(準確的說是濃度為66%以上的乙醇)的特性。苯酚-氯仿抽提后取上層水相,加入無水乙醇,輕輕混勻后即出現絲狀的沉淀。離心,棄去上清,沉淀即為核酸。最后利用TE緩沖液重新溶解核酸,即可作為PCR的模板。

說明:由于PCR實驗對于模板純度要求并不高,因此不需去除雜質,同樣可以PCR的模板。例如對于單細胞的微生物、血細胞或培養的細胞,利用SDS破壞細胞膜結構使DNA釋放出來,即可直接作為模板。對于較復雜的動植物組織則添加蛋白酶K進行適當消化,即可達到同樣的目的。

常見的DNA模板制備方法

常見的DNA模板制備方法有CTAB法、SDS法、蝸牛酶法、蛋白酶K消化裂解法、堿裂解法、煮沸法、微波法等。不同的方法適合處理的樣本種類也有所不同,下面分別就這些方法做一介紹:

CTAB法

CTAB法通常用于植物DNA的提取。CTAB是一種陽離子去污劑,可溶解細胞膜并與核酸形成復合物,該復合物在高鹽溶液中(0.7mol/L NaCL)是可溶的,當降低溶液的濃度到一定程度(0.3mol/L NaCL)時從溶液中沉淀。
研磨破碎細胞后加入65℃預熱的CTAB,通過離心就可以將CTAB與核酸的復合物同蛋白、多糖類物質分開,然后將CTAB與核酸的復合物沉淀溶解于高鹽溶液中,加入乙醇使核酸沉淀(CTAB能溶解于乙醇中,不會沉淀),最終收集得到核酸。

蝸牛酶法

蝸牛酶法常用于真菌基因組DNA的提取。其原理為利用蝸牛酶裂解細胞,隨后經蛋白變性、酚-氯仿抽提、乙醇沉淀等步驟即可得到基因組DNA。

微波法

微波法可以用于真菌基因組DNA的提取。其原理為利用微波加熱破碎真菌,并使蛋白變性,隨后經苯酚-氯仿抽提、乙醇沉淀等步驟即可得到基因組DNA。

蛋白酶K消化裂解法

蛋白酶K消化裂解法適用于所有標本的消化處理。蛋白酶K消化液的配方為:

10mM/L Tris-HCL(PH8.0),10mM/L EDTA,150mM/L NaCL,0.5%SDS,100~200ug/ml蛋白酶K(蛋白酶K最好用水配成20mg/ml,臨用時加入消化液中)

在樣本中加入蛋白酶K消化液,待細胞裂解后,經苯酚-氯仿抽提、乙醇沉淀等步驟即可得到模板DNA。

堿裂解法

堿裂解法通常用于從細胞中提取質粒DNA質粒。其原理為將細胞置于強堿性(NaOH)環境,強堿環境使細胞裂解,同時使細胞裂解釋放出來的DNA變性,隨后用酸性溶液中和使溶液處于中性,質粒DNA將迅速復性,而基因組DNA由于分子巨大難以復性。離心后,質粒DNA在上清中,而基因組DNA則與細胞碎片一起沉淀到離心管的底部。通過這種方法即可將質粒DNA從細胞中提取出來。

煮沸法

煮沸法通常用于從細胞中提取質粒DNA。其原理是將細胞懸浮在含有能消化細胞壁的溶菌酶的緩沖液中,然后加熱到100℃使細胞裂解,同時使DNA解鏈、使蛋白質變性。閉環質粒變性后DNA鏈彼此不會分離,當溫度下降后又會重新形成超螺旋分子。染色體DNA不會復性,離心除去變性的染色體DNA和蛋白質,就可以從上清中回收質粒DNA。

RNA模板制備

RNA模板制備通常用TRIzol法,其原理為利用TRIzol試劑裂解細胞,隨后經苯酚-氯仿抽提、異戊醇沉淀等步驟即可得到RNA模板。

由于環境中有大量的RNA酶,在RNA操作的過程中要時刻注意避免RNA的降解,如確保操作環境干凈無污染,操作時帶好口罩、手套,實驗所涉及的器材、材料要經徹底處理,確保無RNA酶等,同時需快速操作縮短實驗時間以避免RNA的降解。

僅供科研

聯系我們

電話:(025)5889-4959

咨詢:[email protected]

地址:南京市高新開發區星火路10號

蘇ICP備14041760號

幸运农场三连中