PCR產物純化的方法

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在PCR擴增完成后,反應體系中除了DNA片段,還存在離子、dNTP、引物及聚合酶等物質,這些物質會對后續的實驗(克隆、測序等)產生不利的影響,需要對產物進行純化回收。回收DNA片段有兩種途徑,即直接回收和從凝膠中回收,每種純化途徑都有相對應的試劑盒。

產物直接純化

在PCR擴增完成后進行瓊脂糖凝膠電泳檢測,在條帶單一無其他雜帶的情況下,可以用產物純化試劑盒對PCR擴增產物直接進行純化。目前市面上的產物純化試劑盒大多是利用吸附柱的方法,其實驗過程為“吸附-洗雜-洗脫”:將PCR產物置于DNA純化柱中,產物中DNA片段會吸附于DNA純化柱上,利用wash buffer通過一系列快速漂洗-離心的步驟,將引物、核苷酸、蛋白、酶等雜質去除(洗雜需重復多次以盡可能的洗去雜質,提高產物純度),最后用洗脫液將DNA片段洗脫。

凝膠回收純化

如果電泳檢測結果存在非特異性條帶,則需要通過切膠將目的條帶分離出來,隨后利用膠回收試劑盒對凝膠回收純化。凝膠回收純化與產物直接純化相比多了一個溶膠的過程,兩者純化原理基本相同。

產物直接純化與凝膠回收純化區別

產物直接純化的回收率比膠回收高,但只適用于電泳結果為單一條帶的情況。凝膠回收純化需要先跑膠然后將目的條帶切膠回收,純化產物更純凈。

注意事項

  • 純化前后都需要進行電泳檢測,純化前電泳目的是驗證是否存在目的基因及是否存在非特異性結果,純化后電泳目的是為了驗證是否純化得到目的基因及計算產物的回收率;
  • 不同純化試劑盒適用的DNA片段長度會有所不同,購買前建議先仔細閱讀說明書。用不適合的試劑盒會影響最終的回收率,甚至無法純化得到目的DNA;
  • 切膠需在長波長的UV燈(紫外燈)下操作,并且快速操作,避免損傷DNA;
  • 如果PCR的擴增模板為質粒,需要用切膠回收的方式進行純化;
  • 試劑盒中結合液含有刺激性化合物,操作時要帶乳膠手套,避免沾染皮膚、衣服和眼睛;

如何提高回收率?

PCR產物純化回收有兩個重要的技術指標:純度和回收率。回收率不理想會使工作量大大的增加,下面就介紹一些能夠提高產物回收率的小技巧:

  • 洗脫液提前在水浴鍋中50-60℃預熱,同時多次洗脫液可以提高回收率;
  • 一些PCR產物中可能存在石蠟油,石蠟油會導致回收率降低,因此建議清除石蠟油;
  • 使用新配的TAE Buffer作為電泳緩沖液,TBE Buffer或反復使用的TAE Buffer都將影響DNA的回收率;
  • 在電泳時上樣孔盡量加滿,這樣可以在后續切膠過程減少回收膠的重量;
  • 切下帶有目的條帶的膠塊體積越小越好;
  • 切膠后利用膠回收試劑盒回收,凝膠溶解要充分,溶完膠后稍涼一下再上柱,高溫條件下DNA不易與柱結合;

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