PCR引物設計

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PCR技術實際上就是在模板DNA、引物、dNTP都存在的條件下依賴于DNA聚合酶的酶促反應,其效率和特異性取決于兩個方面:一是引物與模板的特異結合;二是多聚酶對引物的有效延伸。因此,引物的設計對于PCR極為重要,引物設計的不好,會導致無法順利擴增得到目的片段。

本文主要對PCR引物設計的原則,常見的引物設計工具及引物設計的總體流程做一介紹。

引物設計基本原則

設計PCR引物的目的是為了找到一對合適的核苷酸片段,使其能有效地擴增模板DNA序列。根據多年來的實踐經驗,引物的設計有一些大家都認可的原則。

引物設計有3條基本原則:首先引物與模板的序列要緊密互補,其次引物與引物之間避免形成穩定的二聚體或發夾結構,再次引物不能在模板的非目的位點引發DNA聚合反應(即錯配)。具體實現這3條基本原則需要考慮諸多因素,如引物長度,GC含量,引物堿基分部,Tm值,引物特異性,形成引物二聚體及發夾結構的能值等等。

  • 長度:引物的長度一般為15-30bp,常用的是18-27bp,但不能大于38bp;
  • GC含量:引物GC含量一般為40%-60%,以45-55%為宜,上下游引物GC含量和Tm值要保持接近;
  • 堿基分布:堿基要隨機分布,且引物自身和引物之間不能有連續4個堿基的互補。3’端最好不要是連續堿基,GGG或CCC會導致錯誤的引發,同時3’端最后一個堿基最好不要是A或T,會導致錯配;
  • Tm值:引物所對應的模板序列的Tm值最好在72℃左右,至少要在55-80℃之間,Tm值曲線以選取72度附近為佳;
  • 引物序列在模板內沒有相似性較高的序列,否則容易導致錯配(設計完成后可以使用BLAST檢索,確認引物特異性);
  • 引物二聚體及發夾結構的能值不能過高(能值的絕對值一般不要超過4.5),過高易導致產生引物二聚體帶并且降低引物有效濃度而使PCR反應不能正常進行;
  • 引物修飾:引物的延伸是從3端開始的,不能進行任何修飾;引物的5端限定著PCR產物的長度,它對擴增特異性影響不大。因此,可以被修飾而不影響擴增的特異性;
  • 如果擴增區域為編碼區域,引物3’端不要終止于密碼子的第3位,因密碼子的第3位易發生簡并,會影響擴增特異性與效率;

常用的引物設計軟件

目前引物的設計主要借助一些分子生物學軟件或在線工具來實現。常見的引物設計軟件有Oligo 6、Premier Premier、Primer 3、Vector NTI Suit、Dnasis、Omiga、Dnastar等。最為常用的是Oligo 6、Premier Premier及Primer 3。

Oligo 6

Oligo是一款非常著名的軟件,可以實現引物的設計及引物的評估分析,是目前最好、最專業的引物設計軟件。其主要功能包括:普通引物對的搜索、測序引物的設計、雜交探針的設計以及評估引物對質量等等。

Premier Premier

PremierPremier是由加拿大的Premier公司開發的專業用于PCR或測序引物以及雜交探針的設計和評估的軟件,也是一款應用很廣泛的軟件。利用該軟件還可以實現簡并引物的設計。

Primer 3

Primer 3是由美國whitehead生物醫學研究所基因組研究中心在因特網上提供的一款免費的在線PCR引物設計程序(在線網址:http://primer3.ut.ee/),一個非常簡單卻高效的引物設計在線軟件。只需在目標序列中粘貼DNA序列后點擊搜索即可。其中,可通過多種方式來對結果進行篩選,包括PCR產物的大小、引物大小、Tm范圍和其它參數。同樣,還可使用Primer3來設計用于PCR-ELISA的雜交探針和其他基于探針的PCR引物設計。

引物設計流程

引物設計及初步篩選

運用軟件Premier Premier或Primer 3來設計引物,再用軟件Oligo6進行引物評估,就可以初步獲得一組比較滿意的引物。

引物的二次篩選

引物的二次篩選是指在初次篩選出的幾對引物中進一步篩選出合適我們進行特異、高效PCR擴增的那對引物。本步驟應注意一下兩點,一是得到一系列引物分別在Genebank中進行回檢。也就是把每條引物在對比工具(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/)的blastnr中進行同源性檢索,棄掉與基因組其它部分同源性比較高的引物,也就是有可能形成錯配的引物。一般連續10bp以上的同源有可能形成比較穩定的錯配,特別是引物的3’端應避免連續5-6bp的同源。二是以mRNA為模板設計引物時要先利用生物信息學的知識大致判斷外顯子與內含子的剪切位點,然后棄掉正好位于剪切位點的引物。

引物的修飾

引物確定以后,可以對引物進行必要的修飾,例如可以在引物的5′端加酶切位點序列;標記生物素、熒光素、地高辛等。

引物的最終評估

經過初次篩選和二次篩選后得到的那對引物便可以用于合成,合成后我們經過PCR擴增可以對引物進行最終的評估。一是PCR擴增的特異性和效率。經過PCR條件優化后能否獲得特異性條帶,即無目的條帶之外的多余條帶。另外,PCR產物的量是否足夠,即無不出帶和條帶很弱的現象。二是以DNA為模板設計引物時,PCR擴增產物是否與預期PCR產物大小相當。如果差距太大(大于100bp),有可能是錯配產物,三是是否形成引物二聚體帶。
我們結合引物最終評估和測序的結果可以對引物設計的成敗做出判定,為我們以后進行引物設計積累寶貴的經驗。

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