PCR問題及提高PCR擴增特異性的方法總結

相關技術:PCR標準操作流程

本文根據自身實驗經驗總結,針對PCR實驗過程出現的問題舉例,提供可實施的解決方法。并根據經驗列舉了提高PCR反應特異性的方法。

下載

PCR常見問題分析

問題1:假陰性(無擴增產物)

現象:正對照有條帶,樣品無條帶

可能原因:

  • 模板:含有Taq酶抑制劑、雜蛋白,模板上樣量低或模板降解
  • 引物:引物降解,引物設計不合理
  • 試劑:酶失活,buffer不合適
  • 反應條件:退火溫度高,延伸時間短

解決方法:

  • 純化模板并重新提取,并檢測模板是否含有抑制劑
  • 重新設計引物并低溫保存
  • 優化buffer,摸索鎂離子濃度或適當加入DMSO(小于0.3%)
  • 提高退火溫度,增加延伸時間(反應條件參照試劑盒說明書)

問題2:假陽性

現象:空白對照出現條帶

可能原因:

  • 引物設計不適,與目的序列具有同源性
  • 試劑污染:水、移液槍等被核酸污染
  • 樣品間出現交叉污染

解決方法:

  • 實驗儀器高壓滅菌
  • 實驗試劑(酶除外)高壓滅菌,離心管槍頭一次性使用
  • 規范實驗操作
  • 假陽性可通過巢式PCR解決,或者使用特異性較高的試劑盒擴增

問題3:拖尾、彌散

現象:電泳出現拖尾、涂抹帶

可能原因:

  • 酶用量過多
  • 模板純度較低
  • dNTP、鎂離子濃度過高
  • 循環次數過多

解決方法:

  • 減少用酶量或使用特異性高的熱啟動酶擴增
  • 純化模板
  • 減少dNTP用量,摸索鎂離子濃度
  • 減少循環次數

問題4:二聚體及非特異性產物

一般小于100bp的條帶可基本判斷為引物二聚體

主要原因:

  • 引物設計不合理,引物自身具有互補性
  • 引物濃度不適
  • 鎂離子濃度過高,退火溫度過低

解決方法:

  • 重新設計引物并進行BLAST檢測
  • 降低鎂離子濃度,提高退火溫度
  • 增加模板用量

提高PCR反應特異性的方法

  1. 引物的設計
  2. 引物最好在模板cDNA的保守區設計,長度15-30bp,GC含量小于60%,3’端不超過連續三個G或C,堿基分布錯落有致,避免引物自身形成二聚體,設計完成之后,需進行BLAST檢測,如果與其他基因不具有互補性,則可以進行下一步實驗。

  3. 降落PCR
  4. 降落PCR是一種簡單的降低非特異性產物的PCR,最大的優點就是可以降低實驗耗時,同時又可以優化實驗的步驟。引物的設計決定退火溫度,退火溫度過高會使PCR效率過低,過低則會使非特異擴增過多。這雖然可以通過反復嘗試來優化,但費時費力。降落PCR提供了一個較為簡易的優化方法。首先在較高的溫度下擴增,此時雖然擴增效率低,但非特異擴增基本沒有。隨著退火溫度的降低,非特異擴增會逐步增多。但由于此時特異的擴增產物已經達到一定的數量優勢,因此會對非特異擴增產生強烈的競爭抑制,從而大幅提高PCR的特異性和效率。

  5. 熱啟動擴增
  6. 采用熱啟動方法進行擴增,是除了設計最佳引物之外,提高PCR反應特異性最好的方式。在一般的PCR反應中,試劑的配置需在冰上進行,且要將PCR儀預熱,這種方法就類似于熱啟動,能夠一定程度的抑制錯配。但是酶在低溫下也存在活性,只要體系中有DNA鏈存在,就會擴增產生非特異性條帶。采用熱啟動的方法就是在達到變性溫度之前完全抑制酶的活性,而最有效的方法就是使用熱啟動酶或高保真酶去擴增,它的原理就是采用化學修飾的方法封閉酶的活性中心,當溫度上升到95℃時恢復活性,指導擴增。

  7. 巢式PCR
  8. 采用巢式PCR進行擴增,在多輪擴增結果中提高擴增特異性和靈敏度。與普通PCR不同的是,它采用兩對引物進行擴增,首先用第一對引物普通PCR,然后將第一輪擴增的產物稀釋100倍后用第二對引物(巢式引物)二次擴增。因此采用巢式PCR可以大大增加困難模板擴增的特異性和有限靶序列的靈敏度。

  9. 合適的瓊脂糖凝膠的濃度

瓊脂糖凝膠濃度與DNA分離范圍

瓊脂糖凝膠濃度 DNA分離范圍
0.3% 5000-60000
0.5% 1000-30000
0.7% 800-12000
1.0% 500-10000
1.2% 400-7000
1.5% 200-3000
2.0% 50-2000
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