PCR實驗操作注意事項

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PCR技術具有重復性好、靈敏度高、快速簡便等突出優點,是科研研究最常用到的技術之一。但是由于靈敏度高,實驗操作人員細微的操作失誤就可能導致產生污染或沒有擴增出目的條帶,因此PCR實驗對操作有一定的要求。本文對PCR實驗操作中的注意事項、PCR實驗污染問題及預防措施做一介紹。

PCR實驗操作注意事項

材料準備

  • PCR所用試劑除buffer外均不宜反復凍融,試劑最好分裝使用。
  • 模板:PCR所用的模板一般稀釋至納克數量級,用量不宜過多,模板濃度過高會導致PCR實驗失敗(如何確定模板的用量?)。同時模板內避免含有酶抑制劑、蛋白酶、核酸酶等物質。
  • 引物:詳細引物設計原則請參見“PCR引物設計”一文。反應體系中引物濃度要合適,太高容易引起錯配及非特異性產物的形成。
  • 酶:為了降低非特異性反應,酶最好最后加入PCR反應體系中。
  • dNTP:四種dNTP的濃度要相同且濃度不宜過高,否則會引起錯配。

實驗操作

  • 對照設置:最好設置陽性、陰性對照。設置陽性對照可證明實驗體系正常,防止PCR抑制造成的假陰性。陰性對照可驗證是否存在基因組DNA的污染。
  • 添加試劑:PCR試劑對溫度十分敏感,最好需要通過冰浴使得PCR試劑和PCR板/管處于0℃,所有試劑加好后要混勻。
  • 電泳檢測:擴增產物最好在48h以內檢測,有些最好于當日電泳檢測,大于48h后帶型不規則甚至消失;

PCR常見問題分析及解決方法介紹

PCR污染問題

PCR實驗中一個令人頭痛的問題是易污染,極其微量的污染就可造成假陽性結果。導致污染的原因有:
樣本污染:收集標本的容器被污染;標本放置時,由于密封不嚴溢于容器外;容器外沾有標本造成交叉污染
試劑污染:在PCR試劑配置過程中,由于加樣器、容器、雙蒸水及其它溶液被PCR核酸模板污染;
PCR產物污染:最主要的污染源。如果在PCR實驗過程中形成了氣溶膠(在空氣與液體面摩擦時、在操作時比較劇烈的搖動反應管,開蓋時、吸樣時及污染加樣器的反復吹打都可形成氣溶膠,一個氣溶膠可含48000拷貝),則氣溶膠可能對之后進行PCR擴增實驗產生污染。

防止措施

  • 實驗分區:將實驗分在4個區域進行,分別為試劑儲存和準備區,樣品制備區,擴增區,擴增產物分析區。各個區域相互獨立,儀器設備和各種物品分開,不能串用;
  • 實驗前后按要求作好實驗室的清潔消毒工作,特別是實驗完成后,消毒工作一定要徹底,破壞殘留的DNA;
  • 降低PCR實驗的頻率(例如能一次做50個,不要分開5次每次做10個);
  • 在PCR實驗操作過程中,工作人員都必須戴勝手套,并經常更換(加模板DNA后必須更換);
  • 每次實驗前應做好吸嘴、Rppendorf管、反應管、加樣器、離心管等物品的高溫消毒。常規消耗用品用后作一次性處理,避免反復使用造成污染;
  • 試劑管用前先瞬時離心(離心10s),使液體沉于管底,減少污染手套與加樣器機會;
  • 引物稀釋時,要首先瞬時離心,以避免粉末狀引物在開蓋時彈出管外;
  • 正確使用加樣器:吸樣時要特別小心應緩慢勻速,避免液體濺到加樣器頭上,盡量一次性吸完,忌反復多次抽吸,以免交叉污染或產生氣溶膠。打出液體后拇指不應松開按鈕,將吸嘴壓掉后再將拇指松開,避免液體回吸;
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