巢式PCR

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常規PCR在對模板進行擴增的過程中,引物與模板之間會出現非特異性配對,導致產生非特異性產物。為了提高PCR擴增的特異性,人們對常規PCR進行技術改良,發明了巢式PCR(nested PCR)。

巢式PCR是指利用兩套PCR引物進行兩輪PCR擴增,第二輪的擴增產物才是目的基因片段。巢式PCR的實驗原理為根據DNA模板序列設計兩對引物,利用第一對引物(稱為外引物)對靶DNA進行15-30個循環的標準擴增(見圖1);第一輪擴增結束后將一小部分起始擴增產物稀釋100-1000倍加入到第二輪擴增體系中作為模板,利用第二對引物(稱為內引物或巢式引物,結合在第一輪PCR產物的內部)進行15-30個循環的擴增(見圖1),第二輪PCR的擴增片段短于第一輪。

巢式PCR原理

圖1:巢式PCR擴增流程

與常規PCR技術相比,兩套引物的使用提高了擴增的特異性,因為和兩套引物都互補的靶序列很少。如果第一次擴增產生了錯誤片段,內引物與錯誤片段配對擴增的概率極低,因此提高了PCR擴增反應的特異性與靈敏度。

巢式PCR特點

  • 克服了單次擴增平臺期效應的限制,使擴增倍數提高,從而極大的提高了PCR的敏感性;
  • 由于模板和引物的改變,降低了非特異性反應連續放大進行的可能性,保證了反應的特異性;
  • 內測引物擴增的模板是外側擴增的產物,第二階段反應能否進行,也是對第一階段反應正確性的鑒定,因此可以保證整個反應的準確性及可行性。

注意事項

巢式PCR的注意事項與常規PCR基本相同。除此之外,巢式PCR實驗還需要注意兩輪擴增引物的比例:如果第一次引物過量的話,剩余引物第二次PCR擴增的時候同樣能有一定的產量,這對于第二次PCR反應而言就是非特異性的產物。在第一次PCR時,應盡量摸索引物最低的加入量,同時適當增加循環次數,盡量消耗體系中的殘余引物。

常見的巢式PCR技術

除了常規巢式PCR外,巢式PCR還有多種形式的擴展,下面分別做一介紹:

半巢式PCR

巢式PCR是利用第一輪PCR產物作為第二輪PCR的模板,除使用第一輪的一對特異引物之外,在第二輪PCR反應中使用一對新的特異引物,共使用四條特異性引物進行DNA擴增。半巢式PCR與巢式PCR原理相同,只是在第二輪PCR反應中使用的引物有一條為第一輪PCR的引物,這種利用三條引物進行兩次PCR擴增的方法稱為半巢式PCR( semi-nested PCR)。

在一些需要利用巢式PCR進行擴增的實驗中,如果基因的3’末端或者5’末端無法設計出兩條引物,可以使用半巢式PCR。

反轉錄巢式pcr

反轉錄巢式PCR( RT-nested PCR)是在反轉錄PCR的基礎上發展起來的,在通過反轉錄獲得cDNA的基礎上,對目的基因進行巢式PCR擴增。它和簡單的反轉錄PCR一樣是用于檢測某種RNA是否被表達或者比較其相對表達水平,但是特異性更高、可靠性更強,可用于拷貝數較低的RNA的擴增,例如擴增丙型肝炎病毒(HCV)感染者體內的HCV基因。

單管巢式PCR

單管巢式PCR是在傳統巢式PCR的基礎上將兩對PCR引物作特殊的設計,巢式外側兩個引物為25bp,退火溫度比較高(68℃);巢式內側兩個引物為17bp,退火溫度較低(46℃)。通過控制退火溫度(68℃)使外側引物先行擴增,經過20~30次循環后(第一輪PCR結束),再降低退火溫度(46℃)使內側引物以第一次PCR產物為模板進行巢式擴增。單管巢式PCR兩輪PCR反應均在一個PCR管中進行,減少了交叉污染的可能性。

共有序列巢式PCR

共有序列巢式PCR( consensus nested PCR),又稱為共有引物巢式PCR( consensus primer nested PCR),根據同一種屬內較為保守的序列設計簡并引物,通常第一輪PCR引物的簡并堿基較多,第二輪PCR引物的簡并堿基較少一些,擴增長度為200~300bp。引物通常設計在能夠區分微生物的不同亞型的區域內。對于某一種生物,例如病毒,種屬內型別很多,但檢測樣本中的病毒型別又不確定,使用共有序列巢式PCR擴增獲得目的序列,進而通過測序獲得未知微生物的信息,是一種敏感而又簡便易行的檢測方法。

共有序列巢式PCR引物設計尤為重要,在引物設計之前要搜集可能相關的所有DNA序列,利用軟件進行嚴格的序列對比分析,從中找出保守的序列,在這部分序列中可能仍存在一些核苷酸的多樣性,則在具有多樣性核苷酸的位置上設計為簡并堿基,將所出現的所有核苷酸多樣性均要考慮,第二輪PCR擴增產物長度控制在200~300bp左右。由于引物中簡并堿基較多,要摸索適合的退火溫度。

巢式PCR應用

巢式PCR大多應用在當模板DNA含量較低時,用一次PCR難以得到滿意的結果,這時用巢式PCR的兩輪擴增可以得到很好的效果。

巢式PCR操作簡單,所需條件與常規PCR相同,但與常規PCR相比進一步提高了反應的特異性與靈敏性,在微生物學、生物信息學、生物醫學等方面有著極其廣泛的應用。例如巢式PCR技術與RFLP(限制性片段長度多態性)技術結合,通過設計高度保守序列的引物對待檢物種DNA進行PCR擴增,對PCR產物進行RFLP分析,從而完成DNA分子水平上的多態性檢測,該法常用于流行病學的調查和臨床常規檢測。

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參考文獻

[1]程小華,楊飛等.巢式PCR檢測血清樣品中HCV RNA的穩定性[J].2011,32(4):526-528;

[2]黃留玉.PCR最新技術原理、方法及應用[M].北京:化學出版社,2011:38-51;

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