免疫共沉淀實驗流程及注意事項

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免疫共沉淀(Co-Immunoprecipitation)是以抗體和抗原之間的專一性作用為基礎的用于研究蛋白質相互作用的經典方法。是確定兩種蛋白質在完整細胞內生理性相互作用的有效方法。 免疫共沉淀實驗的操作步驟比較多,要得到一個完美的實驗結果,不僅需要高質量的抗體,對免疫沉淀體系也需要有嚴格的控制指標。在免疫共沉淀的實驗過程中,從蛋白樣品處理、抗體-瓊脂糖珠復合物洗滌到最后的鑒定,每步都非常關鍵,需要嚴格控制實驗流程中每個關鍵步驟的質量,才能達到最終的實驗目的。

免疫共沉淀實驗流程

該免疫共沉淀操作步驟是將抗體先結合到蛋白A/G瓊脂糖珠上,然后再與抗原混合。相對其他方法,最終的得率較低,但避免了抗體共洗脫的問題。如果希望獲得高純度的目的蛋白,而不考慮非特異性結合,可以將抗體和蛋白樣品在加入蛋白A/G瓊脂糖珠之前進行混合,這樣最后抗體也會和目的蛋白一同被洗脫下來,從而可能會對蛋白質印跡法(western blot)檢測造成干擾。

操作步驟

  1. 用預冷的磷酸緩沖液洗滌細胞兩次,最后一次吸干磷酸緩沖液;
  2. 加入預冷的RIPA Buffer(1 ml/107個細胞、10 cm培養皿或150 cm2培養瓶,0.5 ml/5×106個細胞、6cm培養皿、75cm2培養瓶);
  3. 用預冷的細胞刮子將細胞從培養皿或培養瓶上刮離,把懸液轉移到干凈的1.5ml EP管中。并置于低速搖床,4℃緩慢晃動15min(EP管插冰上,置水平搖床上);
  4. 4℃,14000rpm離心15min,立即將上清轉移到一個新的離心管中;
  5. 將Protein A/G瓊脂糖珠用磷酸緩沖鹽溶液洗兩遍,用磷酸緩沖鹽溶液配制成50%的Protein A/G瓊脂糖珠工作液,建議減掉槍尖部分,避免在涉及瓊脂糖珠的操作中破壞瓊脂糖珠;
  6. 在樣品中以每1ml中加100μl的比例,加入50%的Protein A/G瓊脂糖珠工作液。水平搖床4℃搖動10min(EP管插冰上,置水平搖床上),該步驟的目的是去除非特異性結合的蛋白;
  7. 4℃,14000rpm離心15min,將上清轉移到一個新的離心管中,去除Protein A/G瓊脂糖珠;
  8. 做蛋白標準曲線(Bradford 法),測定蛋白濃度,測前將總蛋白至少稀釋1:10倍以上,以減少細胞裂解液中去垢劑的影響(定量,分裝后,可以在-20℃保存一個月);
  9. 用磷酸緩沖液將總蛋白稀釋到1μg/μl以降低裂解液中去垢劑的濃度。如果覺得你的目的蛋白的濃度低了,可以將總蛋白濃度提高到10μg/μl(假設濃度足夠);
  10. 加入一定體積的抗體到500μl總蛋白中,抗體的稀釋比例因與它有作用的蛋白在不同細胞系中的多少而異;
  11. 4℃緩慢搖動抗原抗體混合物過夜或室溫2h;激酶或磷酸酯酶活性分析建議用2h室溫孵育;
  12. 加入100μl Protein A瓊脂糖珠來捕捉抗原抗體復合物,4℃緩慢搖動抗原抗體混合物過夜或室溫1h,如果所用抗體為鼠抗或雞抗,建議加2μl過渡抗體;
  13. 14000rpm瞬時離心5s,收集沉淀,并且用預冷的洗滌緩沖液(或者預冷的磷酸緩沖鹽溶液)洗滌3遍(每次加入800μl),RIPA Buffer有時候會破壞瓊脂糖珠-抗原抗體復合物內部的結合,可以使用磷酸緩沖鹽溶液;
  14. 用60μl 2×上樣緩沖液將瓊脂糖珠-抗原抗體復合物懸起,輕輕混勻,緩沖液的量依據上樣多少的需要而定(60 μl足夠上三道);
  15. 以游離抗原,抗體,珠子,離心,將上清電泳,收集剩余瓊脂糖珠,上清也可以暫時凍-20℃,留待以后電泳,電泳前應再次煮5min變性;

注:RIPA配制:150mM Nacl,1%乙基苯基聚乙二醇,1%脫氧膽酸鈉,25mM Tris-HCl緩沖液(PH7.6),0.1%SDS。
免疫共沉淀實驗流程

免疫共沉淀實驗流程

通過免疫共沉淀確定未知結合蛋白

該實驗的思路為:先通過免疫共沉淀實驗,得到結合蛋白,隨后對得到的結合蛋白進行測序。

  1. 用磷酸鹽緩沖液洗30塊10 cm培養板上的適宜細胞。刮去每塊板上的細胞到1 ml冰冷的EBC裂解緩沖液中;
  2. 將每毫升細胞懸液轉移到微量離心管中,在微量離心機上4℃以最大速度離心15min;
  3. 收集上清(約30 ml)并加入30 μg的適當抗體,4℃搖動免疫沉淀物1 h;
  4. 加入0.9 ml的瓊脂糖蛋白A懸液,4℃搖動免疫沉淀物30 min;
  5. 用含900 mmol/L NaCl的NETN洗瓊脂糖蛋白A混合物,再重復洗5次。最后,用NETN洗一次;
  6. 吸出混合物的液體部分。加入800 μl的1×SDS膠加樣緩沖液到球珠中,煮沸4min;
  7. 將樣品加入到大孔的不連續SDS-PAGE梯度膠中,在10mA的恒定電流下電泳過夜;
  8. 通過考馬斯亮藍染色觀察蛋白質泳帶;
  9. 從膠上切下目標帶,將其放到微量離心管中,用1ml 50%乙腈洗兩次,每次3 min;
  10. 用胰蛋白酶消化膠中的蛋白質,再進行電洗脫;
  11. 通過窄孔高效液相色譜分離肽。將收集的肽進行Edman降解測序。

注意事項

1)細胞裂解采用溫和的裂解條件,不能破壞細胞內存在的所有蛋白質-蛋白質相互作用,多采用非離子變性劑(NP-40 或Triton- X-100)。每種細胞的裂解條件是不一樣的,通過經驗確定;
2)不能用高濃度的變性劑(0.2%SDS),細胞裂解液中要加各種酶抑制劑;
3)使用對照抗體:單克隆抗體:正常小鼠的IgG或另一類單抗;兔多克隆抗體:正常兔IgG;
4)確保共沉淀的蛋白是由所加入的抗體沉淀得到的,而并非外源非特異蛋白,單克隆抗體的使用有助于避免污染的發生;
5)要確保抗體的特異性,即在不表達抗原的細胞溶解物中添加抗體后不會引起共沉淀;
6)確定蛋白間的相互作用是發生在細胞中,而不是由于細胞的溶解才發生的,這需要進行蛋白質的定位來確定。

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