單克隆抗體的分類

以細胞融合為基礎的鼠雜交瘤技術的發展,使得人們能夠大量獲取高親和性和強特異性的鼠單克隆抗體(McAb)下載,McAb在理論和實踐上的應用成為解決生物學和醫學等許多重大問題的重要手段。但是鼠源性單抗應用于人類的臨床應用結果反映出了單克隆抗體藥物存在的一些問題 :
  • 鼠源性單抗容易容易產生人抗鼠抗體(HAMA) ,在體內作為異源蛋白被清除掉,從而削弱其治療的有效性。
  • 鼠源性單抗在人體內生物活性降低,其Fc段不能有效激活人體FcRn及補體系統的效應功能。
  • 鼠源性單抗在人體內的半衰期短,因而降低了其療效。
因此,人們一直致力于人源性抗體的研究,鼠抗體人源化就是通過基因改造,使其和人體內的抗體分子具有極其相似的輪廓,從而逃避人免疫系統的識別,避免誘導HAMA(人抗鼠抗體)反應。進行抗體的人源化有兩個基本原則:保持或提高抗體的親和力和特異性;大大降低或基本消除抗體的免疫原性。人源化有多種方案,都必須遵循這兩個原則,尤其不能喪失抗體特異結合的能力。

單克隆抗體的分類

鼠源性單抗

人用鼠源單抗的生產方法一般分為體內法和體外法2種。

體內法:體內法即腹水法。盡管腹水中抗體濃度比較高(2-10mg/ml),但由于所用的BALB/c小鼠必須達到SPF級,繁殖、飼養BALB/c小鼠及生產腹水、純化抗體的廠房必須符合GMP要求,WHO及我國對體內法生產的人用鼠源單克隆抗體的質檢項目繁多,要求嚴格,因此限制了體內法在人用鼠源單抗生產領域的應用。
體外法:體外法(雜交瘤細胞體外培養法)的產品純度高,可以避免鼠類病毒的污染,簡化質檢項目,操作具有可控制性,適用于大規模工業生產,因此是人用鼠源單抗生產方式的主要發展方向。體外法的制備流程也基本相同,即從超免疫的供體中即抗原免疫的小鼠獲取脾細胞,選育出非分泌免疫球蛋白缺陷型的骨髓瘤細胞,待細胞融合后,對單個細胞進行克隆,體外培養出能分泌單抗的克隆細胞。

人鼠嵌合性單抗(Chimeric Antibody)

人鼠嵌合性單克隆抗體第一代人源化抗體是將鼠McAb的可變區和人抗體的恒定區組成嵌合抗體。由于異源性Ab的免疫反應約有90%是針對恒定區(C區),要降低mAb的抗原性,必須對Ab的恒定區進行人源化。構建嵌合抗體的大致原理是,從分泌某mAb的雜交瘤細胞基因組中分離和鑒別出重排的功能性可變區(V區)基因,經基因重組與Ig恒定區基因相拼接,插入到適宜的表達載體中,構成鼠/人嵌合的輕重鏈基因表達質粒,經轉染骨髓瘤細胞,通過篩選即可制備出鼠/人嵌合抗體。這種嵌合抗體同鼠源抗體比較至少有以下兩個優點:
  • 它可以按需要對抗體的效應基因進行選擇或剪切。例如人Ig的同種型IgG1和IgG3對介導補體依賴及細胞介導的溶解作用具備優勢,因而利用該技術可以拼接不同亞類的人C區基因,來改變抗體的效應功能,使原細胞毒性較低的IgG2a和IgG2b變成細胞毒性較高的IgG1和IgG3,增強抗體的免疫治療功能,可用來殺死腫瘤細胞。
  • 在治療中使用人而不是鼠mAb的同種型,減小了鼠源mAb作為異種蛋白對人體的免疫原性,它通過避免抗同種型抗體的產生,減少了HAMA的生成。例如,當鼠對鼠Ig互補決定區(CDR)產生免疫耐受時,用鼠抗-淋巴細胞Ab可以激發抗獨特型反應,但相對那些對可變區不耐受的動物來說,該鼠的抗獨特型反應被推遲并很微弱。
    迄今已研制出很多鼠/人嵌合抗體,有些已陸續進入臨床應用,主要用于惡性腫瘤的診療,它在預防移植排斥反應也取得了較為滿意的效果,在治療自身免疫疾病以及控制藥物過量、藥物過敏反應中已顯示出巨大優勢。但是因為有鼠McAb可變區的存在,應用時仍會引起較強烈的HAMA反應。在此基礎上,進一步將鼠McAb可變區中相對保守的FR換成人的FR,僅僅保留抗原結合部位CDR(即CDR移植)—即把鼠抗體的CDR序列移植到人抗體的可變區內,所得到的抗體稱CDR移植抗體或改型抗體,也就是真正意義上的人源化抗體。

CDR移植單抗(CDR Grafting Monoclonal Antibody)

完全CDR移植抗體(改型抗體)

完全CDR移植抗體由于鼠源性抗體VR中的骨架區仍殘留一定的免疫原性,為最大限度的減少鼠源成分,用人FR替代鼠FR可形成更為完全的人源化抗體,即在此抗體中除了3個CDR是鼠源以外,其余全部是人源結構,這一類型的抗體稱為CDR移植抗體或改型抗體。CDR移植抗體中非人序列含量低(約5%),研究已證實其免疫原性大大減小,并且在人體內的血清半衰期延長。

CDR移植技術的理論依據是:

CDR移植單抗

  • CDR是決定抗原結合位點的唯一結構,因而也是抗體特異性和親和力的決定部位。
  • 框架區能夠接受外源CDR的植入。CDR移植不僅可以降低mAb的免疫原性,而且還可以把鼠源mAb與Ag結合的性質授予人抗體。
    應用這一策略,將鼠源McAb的CDR區完全移植,得到了抗磷脂酰肌醇(蛋白)聚糖嵌合抗體。但隨后多項研究發現,簡單的CDR移植往往明顯降低抗原-抗體反應的親和力,甚至喪失與抗原結合的能力。其原因在于FR不僅作為骨架對CDR起到支持作用,FR中的某些非CDR區補充調控殘基還為CDR的回折構象提供必要的支持,其形狀和側鏈大小協同決定CDR的基本結構,影響CDR與抗原結合的特異性和親和力。

部分CDR移植抗體

在簡單CDR移植的基礎上又相繼發展了部分CDR移植技術。研究發現輕鏈的 CDR1、CDR2和重鏈的CDR3對保證抗體與抗原特異性結合至關重要,其余三個CDR的作用則較低。因此只將抗體結合抗原必須的CDR移植到人抗體的FR骨架上即能獲得對人免疫原性更小的嵌合抗體,這類抗體稱為部分CDR移植抗體。目前,對CDR移植的人源化路線是,在鼠/人嵌合抗體的基礎上,通過數據庫檢索、計算機分子模擬等尋找出有最大同源性的人可變區模板,綜合考慮表面殘基、與CDR有相互作用或對空間結構有重要影響的殘基,確定需要保留和改變的關鍵殘基,再通過模擬基因合成,表達檢測實際效果,進行必要的修正,來獲得高親和力的治療mAb。目前已構建出多種針對不同抗原的CDR移植抗體,有些已應用于臨床診治,并取得了令人滿意的效果,如消除腫瘤,延長器官移植生存期,改善類風濕關節炎、全身性脈管炎、感染性疾病及免疫混亂性疾病的臨床癥狀等。

相關文章:人源化抗體構建原則與實驗案例

表面重塑抗體

然而,只通過移植CDR序列產生的人化抗體與抗原結合的能力遠不及其親代鼠源Mab。為了恢復其高親和力,必須對mAb進行進一步的分析、設計、改建工作,使其抗原決定環的結構更加完善。Chothia和LesK首先提出一些框架殘基對CDR構象因此的重要性,并綜合地檢測了所有影響抗原結合的框架殘基。Xiang等發現嵌合抗體B72.3的71和93框架殘基是重鏈超變環構象的主要決定部分。因此,可用親代鼠源抗體的相關序列替代CDR移植抗體V區框架區的關鍵殘基,使CDR構象得以維持。但這同時又增加了鼠源序列的成分,致使免疫原性也加強。從治療的角度考慮,最好是能夠找到框架區變化最小而抗原親和力又很高的人化抗體。盡管有分子模擬法的指導,但要測定哪些框架變化對抗原結合有益,通常需要分析許多不同的抗體突變型。
該策略作為較新的一種人源化途徑,還在逐步成熟階段。鼠源McAb在人體引起的HAMA反應,究竟是完全由其表面的暴露殘基引起,還是由表面殘基與內部殘基的共同貢獻,涉及到抗體產生最基本的免疫學機制,而這種機制仍是目前探討的熱點。盡管有人認為,即使在MHC背景下鼠源McAb被加工和提呈后包埋殘基暴露出抗原性,但誘生的抗抗體也只能和降解的或解折疊的原抗體起反應,不會干擾原抗體的治療效應。

全人源化單抗(Fully Human Monoclonal Antibody)

人源化mAb基本上解決了鼠抗體的最重要問題——免疫原性,但是人源化過程仍很繁復且費用昂貴,它需要廣泛的計算機模型設計,即使如此,大量反復試驗仍不可避免,因為要試驗各種氨基酸置換以測定對目標選擇性和結合親和力的有害作用。而全人源化單克隆抗體是指將人類抗體基因通過轉基因或轉染色體技術,將人類編碼抗體的基因全部轉移至基因工程改造的抗體基因缺失動物中,使動物表達人類抗體,達到抗體完全人源化的目的。
目前生產完全人源化抗體的方法主要包括抗體庫技術和人源性抗體轉基因小鼠技術兩種。

抗體庫技術

抗體庫技術包括噬菌體抗體庫技術和核糖體展示技術。

噬菌體展示技術流程噬菌體抗體庫技術:是利用噬菌體表達外源基因的一項新技術,是將抗體重鏈可變區(VH)和輕鏈可變區(VL)基因與噬菌體的外殼蛋白Ⅲ(PⅢ)或外殼蛋白Ⅷ(PⅧ)基因隨機重組,繼而感染大腸桿菌,后經增殖并在噬菌體表面以抗體片段Fab或單鏈抗體可變區(ScFv)一外殼蛋白的融合蛋白形式表達。這種噬菌體顆粒可以特異識別抗原,又能感染宿主菌進行再擴增,經過“吸附一洗脫一擴增”過程,就能篩選并富集特異性抗體。所構建的抗體庫稱為全套抗體庫,從中篩選到的抗體稱為噬菌體抗體。其最大特點是實現了直接將基因型和表型聯系在一起,可以快速而高效地從大量克隆中篩選出表達特異性的抗體。
核糖體展示技術:將基因型和表型聯系在一起,編碼蛋白的DNA在體外進行轉錄與翻譯,由于對DNA進行了特殊的加工與修飾,核糖體展示技術原理如去掉3′末端終止密碼子,核糖體翻譯到mRNA末端時,由于缺乏終止密碼子,停留在mRNA 的3′末端不脫離,從而形成蛋白質-核糖-2mRNA三聚體,將目標蛋白特異性的配基固相化,如:固定在ELISA 微孔或磁珠表面,含有目標蛋白的核糖體三聚體就可在ELISA 板孔中或磁珠上被篩選出,對篩選分離得到的復合物進行分解,釋放出的mRNA 進行逆轉錄酶鏈聚合反應(RT-PCR),PCR產物進入下一輪循環,經過多次循環,最終可使目標蛋白和其編碼的基因序列得到富集和分離。

人源性抗體轉基因小鼠技術(Transgenic Mouse)

轉基因小鼠制備全人源抗體,要求人的抗體基因片段在小鼠體內必須進行較為有效的重排與表達,并且這些片段能與小鼠細胞的免疫系統信號機制相互作用,使得小鼠在受抗原刺激后,這些人抗基因片段能被選擇,表達并活化B細胞分泌人抗體。其基本方法是采用在鼠胚胎干細胞(ES)中的同源重組來使得鼠原有基因缺失,再通過顯微注射等技術將重建的人源抗體胚系基因微位點轉入小鼠體內,最終由mAb的雜交瘤分泌出全人序列的抗體。轉基因小鼠制備全人源抗體技術是現在全人源抗體制研究的主流,截至2013年,已有5個由轉基因小鼠制備而來的全人源抗體被批準上市,20余個正處在臨床試驗中。目前主要的轉基因小鼠制備全人源抗體技術有HuMAb-Mouse、Xeno Mouse、VelocImmuneTM三種方法。
相關文章:全人源化單克隆抗體制備技術(轉基因小鼠)
HuMAb-Mouse: HUMab轉基因小鼠整合入人抗體基因450kb(200kb Ig H;230kb Igk,約占人類Ig Gκ的50%),免疫該小鼠可以產生0.1-5nmol/L的抗體。雖然該小鼠轉入的人抗體基因組還是比較小,但仍獲得巨大成功。
Xeno Mouse: Xeno Mouse轉基因小鼠也是目前最為成功、應用最廣的轉基因小鼠之一。該轉基因小鼠整合入大部分人抗體VH和Vκ基因,大小分別為1020kb和800kb。重鏈包含34個V區基因、所有的重鏈D區和J區,以及Cγ2、Cμ和Cδ基因,共66個功能基因;輕鏈包含18個V區基因、所有的5個J區和 Cκ基因,共32個功能基因。該轉基因小鼠XMG2-KL可以產生全人IgM和IgG2,親和力可以達0.1~1nmol/L。Xeno Mouse轉基因小鼠制備流程VelocImmuneTM:不同于以往的轉基因小鼠抗體篩選平臺,VelocImmuneTM產生人可變區與鼠恒定區組成的反向嵌合抗體。小鼠Ig H恒定區通過B細胞胞質區的信號轉導區域(如Igα與Igβ)傳遞天然的免疫信號,并通過與其他類型免疫細胞上的Fc受體的結合促使小鼠產生強大的免疫反應,并提供半衰期長且親和力高的抗體。該類轉基因小鼠免疫后產生的抗體可變區編碼序列通過基因克隆技術與人源恒定區編碼序列進行構建,反向嵌合抗體即可轉變為適宜藥用的全人源抗體。
人源性抗體轉基因小鼠技術的主要優點是,其功效優于其他生產抗正常人體蛋白mAb技術。小鼠識別抗原和動員抗該抗原的抗體系統仍保持完整,容易把人體蛋白識別為異物。轉基因小鼠的另一個優點是,由于抗體是體內產生,經歷正常裝配和成熟過程,從而保證成品具有較高的靶結合親和力。

更多閱讀

單克隆抗體結構與作用機制
單克隆抗體技術(雜交瘤技術)簡介

僅供科研

聯系我們

電話:(025)5889-4959

咨詢:[email protected]

地址:南京市高新開發區星火路10號

蘇ICP備14041760號

幸运农场三连中