酵母表達原理

下載

本文主要講述了畢赤酵母蛋白表達的原理,畢赤酵母表達能夠高效表達的機制。
巴斯德畢赤酵母(以下簡稱畢赤酵母)能夠高效表達外源基因,是因為其有更強的強啟動子,即醇氧化酶啟動子PAOX。甲醇營養型酵母能將甲醇分解為甲醛和過氧化氫,在此反應中參與的酶是醇氧化酶(AOX1和AOX2)。其中,AOX2的表達量比AOX1低得多,以甲醇為唯一碳源時,AOX1增至細胞總蛋白的40%。PAOX1受甲醇誘導和葡萄糖或甘油的抑制。因此,AOX1的表達受到甲醇的嚴格控制。

巴斯德畢赤酵母所表達的外源基因位于酵母染色體上,這是通過把攜帶外源基因的表達質粒線性化,以同源重組的方式整合到強啟動子PAOX1的下游,目的基因一般插入到5’AOX1啟動子和轉錄終止子之間的單克隆位點。

畢赤酵母蛋白表達系統

  1. 酵母表達宿主菌
  • Mut+和Muts

在畢赤酵母表達系統中,乙醇氧化酶有兩種基因編碼,即AOX1和AOX2。細胞中絕大多數乙醇氧化酶活力有AOX1提供,菌株利用甲醇的速度主要由AOX1基因表達的AOX1蛋白提供。當AOX1缺失,只存在AOX2時,大部分的乙醇氧化酶活力喪失,這種細胞利用甲醇能力低,在甲醇培養基上生長緩慢的菌株表現型為Muts。存在AOX1,細胞利用甲醇正常生長,在甲醇培養基上生長較快,這種菌株表現型為Mut+,這就是甲醇營養型畢赤酵母表達兩種Muts和Mut+產生的原理。

  • 酵母表達系統常用宿主菌

GS115、KM71、SMD1168是常用的表達宿主菌,均為甲醇誘導型。他們都是組氨酸缺陷型,如果表達載體上帶有組氨酸基因,可以補償宿主菌的組氨酸缺陷,所以可以在不含組氨酸的培養基上篩選重組轉化子。在以葡萄糖或者甘油等為碳源的培養基上生長時,AOX1基因的表達受到抑制,而在以甲醇為唯一碳源時,宿主菌的AOX1基因被強烈誘導,使目的基因大量表達。

  • 有無甲醇誘導產生的Mut+和Muts表現型

畢赤酵母的最適生長溫度為28-30℃,誘導期間超過32℃,不利于蛋白表達,并可能導致細胞死亡。Muts和Mut+菌株在沒有甲醇存在的情況下生長速率一樣,存在甲醇的情況下,AOX1啟動子被強烈誘導,Mut+較Muts生長更快(4-5倍)。

  1. 酵母蛋白表達載體
  • 酵母蛋白表達載體的選擇

酵母表達產物有胞內表達和分泌到胞外表達兩種方式,這取決于表達載體的選擇和構建是否帶有信號肽,可根據基因表達的定位及目的選擇合適的酵母蛋白表達載體。

①?胞內表達載體:主要包括pPIC3、pPICZ、pPSC3K、pHIL-D2等。該類載體將目的基因表達在胞內,可避免酵母的糖基化,適合于通常在胞漿表達或不含-S-S-的非糖基化蛋白,較胞外分泌表達水平高但純化相對復雜。

②?分泌到胞外表達的載體:pPIC9、pHIL-S1、pYAM75P等。酵母本身分泌的外源蛋白很少,將外源蛋白分泌到胞外,有利于目的蛋白的純化和積累。常用的分泌信號序列由89個氨基酸組成α交配因子的引導。

③?多拷貝插入表達載體:pPIC9K、pPIC3.5K。某些情況下,重組基因的多拷貝整合能夠增加蛋白的表達量。

  • 表達重組蛋白使其具體天然的N端

想實現表達重組蛋白使其具體天然的N端,將目的基因直接連接在Kex2蛋白酶切位點之后。Kex2蛋白酶切位點在信號肽序列中谷氨酸和精氨酸連接處:Glu-Lys-Arg*Glu-Ala-Glu-Ala??*位置為Kex2蛋白酶的酶切位點

畢赤酵母表達系統機制/原理

畢赤酵母能夠高效的表達外源基因,是因為其具有強啟動子乙醇氧化酶啟動子(AOX1和AOX2)。AOX1和AOX2及其產生的Muts和Mut+表現型前文已經敘述過。AOX1受甲醇的誘導和葡糖糖或甘油的抑制。畢赤酵母表達的外源基因位于酵母染色體上,通過把構建的質粒/載體線性化(主要采用酶切),通過同源重組的方式整合到啟動子AOX的下游,一般是插入到5’AOX啟動子和轉錄終止子信號之間的單克隆位點。

畢赤酵母同源重組的方式,見酵母蛋白表達系統介紹。

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