酵母蛋白表達步驟/實驗流程

本文主要講述了酵母蛋白表達步驟,詳細酵母表達流程。從感受態細胞制備,轉化方法選擇及操作,從化學試劑PEG1000轉化,電擊轉化,原生質體法轉化三個方法入手及轉化子的篩選及最終的蛋白表達,全套酵母蛋白表達標準操作流程。
下載

質粒線性化

在酵母表達系統中已經介紹了酵母蛋白表達原理,因此線性化是酵母轉化的第一步,采用不同的限制酶酶切可以得到不同的表型。

轉化方法

轉化方法 轉化效率 是否會多拷貝整合 操作
原生質體法 105 操作復雜
電穿孔法(電擊) 105 操作方便
PEG誘導轉化 105 操作方便

畢赤酵母PEG1000轉化及感受態制備

  • 配置緩沖液

1)緩沖液A:1.0M?山梨醇,10mM甘氨酸,pH8.35,3%(v/v)乙二醇,濾膜過濾,-20℃保存;

2)緩沖液B:40%(w/v)PEG1000,0.2M?甘氨酸,pH8.35,濾膜過濾,-20℃保存;

3)緩沖液C:0.15M?NaCl,10mM?甘氨酸,pH8.35,濾膜過濾,-20℃保存;

4)未污染的新鮮、試劑級DMSO,-70℃保存

將DNA直接加在凍結的酵母細胞上是本實驗的關鍵之處(即使在冰上解凍的待轉化細胞,其攝取外源DNA的能力也在解凍過程中迅速下降;樣品的轉化,進行多組試驗。

  • 感受態制備

1)接種酵母受體菌單菌落于YPD平板(YPD:蛋白表達試劑配置),30℃培養2天;

2)挑取平板上的單菌落接種于10mlYPD液體培養基中,30℃搖床震蕩過夜;

3)過夜培養后按1%左右的接種量接種到100mlYPD培養基中震蕩培養至OD值從0.1至0.5~0.8;

4)3000~5000rpm離心收集沉淀菌體,用50ml預冷A液洗滌,并重懸與4mlA液中;

5)根據每次使用量(0.1-0.2ml左右)分裝與1.5ml離心管中,每管加入10ul的預冷DMSO,混合后迅速-80℃/液氮(感受態可以放到-80℃?,但是酵母表達建議感受態現做現用)

  • 酵母轉化

1)線性化質粒50ug(可預冷)溶于200ul的TE中,直接加入凍存的酵母感受態中;

2)37℃水浴5min,過程混合樣品2次;

3)取出加入1.5ml緩沖液B,徹底混勻;

4)30℃水浴1小時;

5)室溫2000rpm離心10min,去上清,得沉淀,重懸菌體與1.5ml緩沖液C中;

6)再次離心,去上清,得沉淀,輕輕加入0.2ml緩沖液C重懸;

7)將重懸的轉化液涂與選擇性培養基(根據抗性配置)中,30℃孵育3-4天,進行鑒定。

畢赤酵母電擊感受態細胞制備及轉化

  • 感受態制備

1)接種酵母受體菌單菌落于YPD平板,30℃培養2天;

2)挑取平板上的單菌落接種于10mlYPD液體培養基中,30℃搖床震蕩過夜;

3)過夜培養后按1%左右的接種量接種到100mlYPD培養基中震蕩培養至OD值1.2~1.5;

4)4℃,5000rpm離心5min收集沉淀菌體,用100ml預冷無菌水重懸菌體;

5)4℃,5000rpm離心10min收集沉淀菌體,用100ml預冷無菌水重懸菌體;

6)再次4℃,5000rpm離心10min收集沉淀菌體,用100ml預冷無菌水重懸菌體;

7)20ml,1mol/L山梨醇洗滌1次;

8)將菌體溶于200ul,1mol/L預冷山梨醇中,不加甘油,-80℃放置幾小時,待轉化

  • 酵母電轉

1)準備好80ul的酵母感受態與線性化的質粒1-5ug(冰上預冷15min)混合,迅速放入0.2cm的電擊杯中(電擊杯冰上預冷滅菌),電擊;

2)電擊結束,迅速加入1ml山梨醇,涂平板(在搖床上培養1h后涂平板也可);

3)MD培養基生長3-4天,ROB培養基上生長4-5天后,鑒定。

  • 電擊注意點

1)線性化質粒的含量在1-5ug,純度越高越好,量要有保證,很多人找不到陽性轉化子可以考慮是否是這個因素造成;

2)感受態菌液收集,確定OD值在1.2-1.5之間,可以稀釋不同倍數,判斷是否是線性關系,菌液渾濁單OD值不高,可能是OD稀釋倍數不夠;

3)感受態保存,感受態制備但其他還沒處理好,冰上放置的時間對轉化效率也會有影響,因此還是那個原則:現做現用;且分裝成每次夠用的量,一旦拿出就不在放回,也避免每次吸取造成污染;

4)電擊杯清洗,先洗凈吹干,浸泡在75%乙醇中,使用前超凈臺紫外滅菌,重復使用對實驗也會有一定影響;

5)電擊參數,電壓及電擊時間可以摸索,適當增加電壓或延長電擊時間,電擊過程冰上操作

畢赤酵母原生質體法轉化及感受態制備

  • 原生質轉化原理

酵母細胞具有細胞壁,細胞壁會組織其對外源DNA的攝入,因此,去除掉部分的細胞壁有利于酵母細胞對DNA的吸收。利用藤黃節桿菌酶(為一種葡聚糖酶),可以部分消化細胞壁。關鍵在于不能過度的消化細胞壁,否則將造成細胞死亡。藤黃節桿菌酶的消化能力受到SDS的影響,可以加入SDS對其消化進行控制,以得到消化適度的細胞。消化獲得70%的原生質細胞時,效果最好。

  • 試劑配制

轉化當天,配制如下溶液:

①?SE:1M山梨醇,25mM?EDTA,pH8.0

②?SCE:SE:1M山梨醇,1mM?EDTA,10mM檸檬酸鈉緩沖液,pH8.5

③?SOS:1M山梨醇,0.3xYPD,10mM?CaCl2

④?CaS:1M山梨醇,10mM?Tris-HCl,pH7.5,10mM?CaCl2

⑤?DTT,PEG:DTT水配制為1M濃度,PEG用水配制40%(w/v)

⑥?CaT:20mM?Tris?pH7.5,20mM?CaCl2

⑦?藤黃節桿菌酶:用水配制成3mg/ml的濃度

⑧?5%SDS溶液,RD融化瓊脂100ml,1M山梨醇

每次轉化時配制

①?SED:19mlLSE加1ml?DTT

②?PEG/Cat:1:1混合40%PEG及Cat

其他試劑

①?YPD培養基1L,YPD平板1L

②?RDB平板1L,RDHB平板1L

  • 感受態制備及消化細胞壁

1)接種酵母受體菌單菌落于YPD平板,30℃培養2天;

2)挑取平板上的單菌落接種于10mlYPD液體培養基中,30℃搖床震蕩過夜;

3)取培養的細胞5ul,10ul,20ul分別加入到含有200mlLYPD的液體培養基中,30℃震蕩過夜(300rpm);

4)第二天測每個培養瓶中的OD600值,并取出事先配置好的轉化溶液,室溫放置:

5)收集OD600值在0.2-0.3對應的培養瓶中的細胞,室溫離心(1500rpm5min左右),得到沉淀;如果沒有培養瓶中的OD值在0.3左右的話,選擇一個培養瓶,用新配置的培養基以1:4稀釋,再次培養(2-3h左右),直至出現OD值為0.2-0.3,收集細胞;

6)準備去除細胞壁,準備去壁試劑和待去壁的細胞;

7)準備去壁試劑:現配SED,保證DTT(分析級)的新鮮度,配完放-20℃;

8)準備帶去壁細胞:先用滅菌水清洗,轉入離心管;1500rpm離心5min,收集細胞,用20mlSED重懸并洗滌離心;再次用1M山梨醇洗滌,離心(同上);用SCE重懸,分開至兩個離心管中(每管10ml左右);

9)準備藤黃節桿菌酶,取一管酶放置冰上,以上準備的兩管細胞取出一管加入藤黃節桿菌酶,開始消化細胞(這一步可確定酶消化的最佳時間);

最佳時間的確定

①?準備20ml?5%SDS溶液分光光度計調至800nm,空白對照為800ul5%SDS及200ul?SCE;

②?準備10個離心管,編號為0,2,4,5,6,7,8,9,10,15,20,25,30,40,45,50(根據時間編號);

③?取上述8步中的另一管細胞,取出200ul加入至0號管中,放置冰上,此為0點;

④?加入7.5ul藤黃節桿菌酶在剩余的細胞中,輕混,30℃孵育(不要晃動)用來建立最佳時間所用

⑤?2min時取200ul懸浮液至2號管中,同理4,5,6,7,8min時重復操作,讀樣品OD800值;

⑥?用公式計算細胞去壁的效率:%去壁率=100-{(T時間OD800-0時間OD800值)x100}

10)計算出去壁率為70%左右時,得出最佳消化時間,同樣操作加入7.5ul消化酶于另一管中消化細胞

11)室溫離心去除懸浮液,1M山梨醇洗滌一次,0.6mlCaS懸浮細胞,立即轉化,去壁的細胞應立即轉化。

  • 轉化畢赤酵母

1)取100ul將去壁細胞,放入1.5ml離心管中(滅菌);

2)準備10ug線性化質粒(預冷)與去壁細胞混合,加入1ml新鮮PEG/Cat溶液,輕混,室溫孵育10min;

3)室溫750rpm離心10min,去除PEG/Cat溶液;并用150ulSOS培養基懸浮轉化細胞,室溫孵育20min;

4)加入800ul?1M山梨醇,涂平板;

5)取200ul轉化細胞和RD(液體)混勻倒于RDB平板上,凝固后導致平板,30℃培養4-6天,出現轉化子;

6)取100ul稀釋細胞,與RDH(液體)混勻,涂在RDHB上,凝固后倒置生長,30℃培養4-6天,出現克隆,表明去壁細胞可再次生長為分裂細胞。

陽性轉化子的篩選與蛋白表達

  • Mut+和Muts表型的判斷

待轉化子在平板上生長一段時間后,進行Mut+和Muts的篩選。挑取單克隆,在MM及MD培養基上劃線或點(先在MM平板上點,再在MD平板上點,一個克隆換一次牙簽),30℃培養2天。觀察,在MD培養基上生長而在MM培養基上不生長或長的很小即為Muts表型,其余為Mut+表型。

  • Mut+的誘導表達

1)挑取單菌落,搖菌,在25mlMGY或BMG或BMGY培養基中,30℃,300rpm培養至OD600為2-6(培養15-18h左右觀察);

2)室溫2000rpm離心5min,收集菌體,用上述培養基重懸,使OD600為1.0左右;將菌液至于1L搖瓶中,30℃300rpm培養,每24小時加入100%甲醇,至終濃度為0.5-1.0%;

3)根據時間點取樣(1ml)至于1.5ml離心管中,離心收集上清和菌體,分析蛋白表達量和最佳收獲時間;

4)可以用SDS-PAGE和Western?blot進行分析鑒定表達情況。

  • Muts的誘導表達

1)挑取單菌落,搖菌,在25mlMGY或BMG或BMGY培養基中,30℃,300rpm培養至OD600為2-6(培養15-18h左右觀察);

2)室溫2000rpm離心5min,收集菌體,用上述培養基重懸,使OD600為1.0左右;將菌液至于1L搖瓶中,30℃300rpm培養,每24小時加入100%甲醇,至終濃度為0.5-1.0%;

3)根據時間點取樣(1ml)至于1.5ml離心管中,離心收集上清和菌體,分析蛋白表達量和最佳收獲時間;

4)可以用SDS-PAGE和Western?blot進行分析鑒定表達情況。

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