IPTG誘導原理(原核表達)及實驗步驟

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在原核蛋白表達體系中,如E.coli(大腸桿菌表達系統),外源基因通常需要誘導劑的誘導才能進行表達,本文詳細講述了常用誘導劑IPTG誘導原理,對外源蛋白誘導表達原理以及實驗步驟。

下載

原核生物絕大多數的基因按功能相關性成簇地排列,且密集于染色體上,共同形成一個轉錄單位——操縱子,也稱基因表達的協同單位。E.coli的乳糖操縱子含Z、Y及A三個結構基因,分別編碼β-半乳糖苷酶(β-galactosidase)、通透酶(permease)和乙酰基轉移酶(transacetylase);此外還有調控基因:操縱序列O(operator)、啟動序列P(promoter);而I(編碼Lac阻遏物,Lac repressor)不屬于乳糖操縱子。

乳糖操縱子結構基因

乳糖操縱子結構基因

IPTG誘導原理

Lac阻遏物是一種具有4個相同亞基的四級結構蛋白,都有一個與誘導劑結合的位點。在沒有乳糖存在時,lac操縱子(元)處于阻遏狀態,Lac阻遏物(即下圖中的阻遏蛋白)能與操縱基因O結合,阻礙RNA聚合酶與P序列結合,阻止了轉錄的路徑,從而抑制轉錄啟動。而當有誘導劑(這里指IPTG)存在時,誘導劑可與阻遏蛋白結合,使阻遏蛋白構象發生變化,導致阻遏物從操縱基因O上解離下來,RNA聚合酶不再受阻礙,啟動子P開始發生轉錄,啟動反應開始發生轉錄。

在這個操縱子(元)體系中,真正的誘導劑并非乳糖本身。乳糖進入細胞,經β-半乳糖苷酶催化,轉變為半乳糖——即生理上的誘導劑。而在實驗中,通常選用異丙基硫代半乳糖苷(IPTG)作為誘導劑,IPTG是一種作用極強的誘導劑,不被細菌代謝而十分穩定,因此被實驗室廣泛應用。

IPTG誘導表達原理圖

IPTG誘導表達原理圖

IPTG誘導表達實驗方法

材料

試劑和培養基 配料
LB(Luria—Bertani)培養基 酵母膏(Yeast extract) 5g
蛋白胨(Peptone) 10g
NaCl 10g
瓊脂(Agar) 1-2%
蒸餾水(Distilled water) 1000ml pH 7.0
IPTG 貯備液 2g IPTG溶于10mL蒸餾水中,0.22μm濾膜過濾除菌,分裝成1mL/份,-20℃保存
凝膠電泳加樣緩沖液 50mmol/L Tris-CL(pH6.8)
50mmol/L DTT
2%SDS(電泳級)
0.1%溴酚藍
10%甘油

原核表達鑒定詳細實驗步驟

  1. 表達鑒定第一天的任務,常用抗性選擇根據感受態細胞選擇
  • 拿到質粒,離心(3000r/min;2min)
  • 在質粒中加入TE【使質粒最終加入到110μL感受態細胞中的量為80-100ng,據此確定加入TE的量】,一般為(1μg質粒加20μLTE;2μg質粒加50μLTE;5μg質粒加100μL?TE)
  • 將質粒與TE混勻,吸取2μL混液與感受態細胞混勻
  • 將感受態細胞放入冰箱(4℃)中,30min
  • 取出后立即放入水浴鍋中(42℃),熱激90s,
  • 再次放入冰箱(4℃)中,3min
  • 拿出后取200μL的LB液體培養基加入到已轉入質粒的感受態細胞中
  • 放入搖床(37℃;??195r)?中,??30nim至60min;?(最佳45min)
  • 取出離心(3000r/min;2min)
  • 去掉200μL的上清,留100μL左右上清懸浮沉淀,吸取50μL懸液涂平板,【先將對應抗性的平板放入培養箱(37℃)中預熱20min】
  • 把平板放入培養箱(37℃),過夜(12h至16h)

2. ?表達鑒定第二天的任務,注意Pcold表達載體的表達溫度

  • 每個平板挑取單菌落至4支對應抗性的LB(4ml)試管中,編號為“0”“1”“2”“3”
  • 將試管放入搖床(37℃;195r)?中,【單抗3h左右;雙抗4h左右;剛開始用可見分光光度計測OD值;熟練后可目測(背光下,以試管中的槍頭為例,剛剛看不見槍頭即可)】,測OD值(0.6至0.8)
  • 從“0”號管中取700μL懸液加入到100μL(C=80%)的保種甘油中,震勻,放入冰箱(-20℃)凍存
  • 在每組菌的“1”“2”“3”號試管中分別加入2μL的IPTG【終濃度0.5mM最適,可根據日后表達摸索】
  • 視不同的載體選擇適合的表達環境【PET/PGEX:15℃表達過夜;25℃表達6h;37℃表達3h至4h(4支試管,“0”“1”號試管15℃表達過夜;“2”“3”試管37℃表達3h至4h)。Pcold:【全部15℃表達過夜】

3. 表達鑒定第三天,全菌的表達鑒定分析,注意控制溶質的量及溶液黏度

  • 從每組4支的試管中均取500μL菌液加入到1.5ml離心管中,【若OD值不一樣,值小的可多取】離心(6000r/min),5min,?去上清,留沉淀【沉淀少的,可再取菌液離心,盡量使沉淀量接近】
  • 在每個離心管中加入500μL的DDH2O,懸浮沉淀,離心(6000r/min),5min,?去上清,留沉淀
  • 在每支離心管中加入45μL的1×PBS和45μL的2×Loading?Buffer懸浮沉淀【當溶質適量且均一的情況下,加入量不變;當溶質多且粘稠時,應使加入量增大,為降低粘度也可減少上液量】
  • 放入煮樣器(100℃)?25min
  • 取出后離心(6000r/min)??3min, ?電泳檢測。
  • 蛋白表達量不錯,進行蛋白純化;蛋白表達量低或者沒表達,可參考原核表達FAQ相對應解決方案解決。

4. 蛋白純化:見蛋白純化專題

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