離子柱常見問題分析及解決方案

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摘要:本文主要針對離子柱純化蛋白中常見的問題進行分析,解釋其原因并提出相應的解決方案。

緩沖液如何選擇

用Tris-HCl還是PB,選擇的依據是蛋白質的穩定性和活力在哪個緩沖液中好,濃度一般50mM,但是緩沖液應與樣品緩沖液有相同的pH和離子強度。

洗脫采用的離子強度的大小范圍應該如何確定

離子交換純化是利用離子交換劑上的可解離基團(活性基團)對各種離子的親和力不一樣達到分離目的的一種蛋白純化分離技術,離子強度越大,洗脫越好。具體的離子濃度范圍可以很大,0.01mol/l到1mol/l,甚至3.0mol/l,PH值的范圍液很廣。主要根據你的蛋白質的等電點。

蛋白掛在陽離子交換柱上洗脫不下來

  1. 蛋白與離子柱得結合太強,換弱陽的瓊脂糖凝膠介質,比如由sp的換成CM。
  2. 減少離子柱與樣品的結合時間,防止蛋白沉在柱上。
  3. 若洗不下來的是雜蛋白直接用0.1M氫氧化鈉洗。

標簽蛋白易洗脫

  1. 離子交換每個梯度都洗下來目標蛋白,最大可能性是上樣量過大,流速太大,建議增加清洗的體積數,減少上樣量,降低上樣速度。
  2. 上樣完洗脫前,清洗的不徹底。
  3. 標簽沒有表達出來:
    • 可能是因為折疊構象不正確導致標簽在重折疊時沒有位于蛋白質分子的表面上無法與離子柱結合。
    • 標簽在折疊時沒有位于蛋白質分子的表面上。
  4. 填料有問題,換填料。
  5. PH、離子強度是否合適,平衡緩沖液是否應與樣品緩沖液pH、離子強度相同。

標簽包涵體蛋白易洗脫

  1. 蛋白質的折疊形態發生了改變隱藏了標簽,而使得蛋白質無法掛柱。
    • 因臨近的空間的一個或多個氨基酸的空間位阻阻礙了標簽與離子柱形成共價鍵。
    • 環境影響:pH,離子強度,其他蛋白質分子,緩沖溶液類型,有關影響蛋白質分子表面的試劑等。增加所提的蛋白質樣品的溶解度或還可以加大離子型、非離子型或兩性離子表面活性劑的濃度或類型。
  2. 柱子沒平衡好,平衡緩沖液沒加咪唑,平衡液PH不適合,緩沖液pH要與蛋白質pI差1-2。
  3. 有比鄰的組氨酸的污染蛋白質與離子柱結合,通過降低洗脫液pH值使得標簽質子化而使得污染蛋白質從層析住上被洗脫。
  4. 一些蛋白質或DNA與帶有標簽的目的蛋白發生了非特異性相互作用,可以用低濃度的去污劑(2%的Triton X-100或濃度不大于0.5%SDS)洗滌樣品(上樣洗脫時)或增加洗脫液的鹽濃度(氯化鈉溶液低于2mol/L)。
  5. 填料有問題,換填料。
  6. 最后可以考慮一下試劑的問題。

目的蛋白先洗脫雜蛋白被吸附

  1. 更換緩沖液,可能pH與蛋白質pI較接近。
  2. 填料選擇不對,與蛋白結合力太弱,更換適合改純化蛋白質的填料。
  3. 直接收取目的蛋白,再用其他純化方法進一步純化。

蛋白純化出現沉淀

  1. pH發生變化,導致蛋白質沉淀。
  2. 離子溶度過高,緩沖液的離子溶度降低。

注意事項

  1. 倒入速度不要太快,以防產生泡沫和氣泡。
  2. 裝柱的注意事項:
    • 裝柱時應注意液面不能低于樹脂表面。
    • 樹脂懸浮液的溫度要相對恒定或與室溫接近,否則柱床體內易產生氣泡而影響分離效果。
    • 裝好的柱體應該沒有“紋路”、節痕和氣泡,并且柱床體表面平整而均勻。否則需要重新裝柱。
    • 在裝柱的同時應該將其他儀器設備(如:恒流泵等)電源接通,并按實驗要求進行預熱和調試。需將恒流泵流速調至0.4ml/min。
  3. 應將洗脫液放至液面與樹脂相切時再上樣,且樣品一旦加入就應該立即開始收集流出液。 (第一管,應在4ml處做一標記)。
  4. 加樣時要沿柱內壁緩慢地加入柱中,以免沖壞樹脂表面,以及在柱內形成氣泡,影響分離效果。
  5. 20%乙醇保存柱子。
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