反向PCR

下載

常規的PCR技術只能對兩端序列已知的DNA片段進行擴增,但在實際工作中常常需要通過基因上一小段已知序列對其鄰近序列進行擴增。為了解決這一問題,科學家們對常規PCR進行技術改進,發明了多種獲得已知基因兩側序列的方法,包括反向PCR、錨定PCR、RACE-cDNA末端的快速擴增等。本文主要對反向PCR做一介紹。反向PCR(inverse-PCR,IPCR)具有與常規PCR方向相反的引物,并且IPCR的擴增方向與普通PCR相反,因此稱為反向PCR。

實驗原理

IPCR實驗是將待擴增片段環化,通過一對方向相反的引物實現已知序列兩側基因序列的擴增(見下圖)。常規PCR的方向是相對的,可以擴增一對引物之間的片段,因此想要擴增引物兩側的基因片段,需要設計方向相反的引物。但用方向相反的引物進行PCR擴增,是無法得到足夠的產物的,因為每個引物只能對各自的模板線性擴增,無法進行指數級增長。為了解決這個問題,需對擴增的DNA模板先進行酶切,然后連接環化,使其引物方向成為相對,而后再進行PCR擴增。

反向PCR技術原理

圖1:反向PCR技術原理

制備流程

引物設計

引物的方向與常規PCR相反,其設計原則與常規PCR相同。

模板制備

取基因組DNA,先用適宜的限制性酶進行切割,隨后去除反應中的限制性酶,再用連接酶將酶切片段進行自身連接,形成一環狀結構(為了提高IPCR效率,有時會將環化模板再次線性化會有利于擴增,即在已知序列的引物之間尋找一合適的酶切位點,且該位點在待研究的側翼未知序列上不存在,用相應的限制性酶消化,即可獲得線性化的模板)。

PCR反應

根據模板設置合適的條件進行PCR擴增。一般來說,在IPCR實驗中只進行一輪PCR是不夠的,通常會設計不同的引物進行兩輪或兩輪以上的PCR反應(巢式PCR)。

產物分析

擴增產物可以通過瓊脂糖凝膠電泳分析判斷其分子量,也可以進行TA克隆并進行測序獲得基因序列。

注意事項

  1. 用限制性酶酶切基因組DNA要徹底(電泳條帶彌散)
  2. 在進行連接反應時,反應體系中不能存在乙醇(痕量的乙醇也會對隨后的連接產生不利影響)
  3. 對基因組的復雜度有一定的限制,對于大于109bp的基因組需要構建小一些的文庫
  4. 擴增片段的長度有一定的限制,盡管現在利用長片段PCR可以對長達幾十kb的片段進行擴增,但對IPCR來說還是很難達到這種境地。為了增加實驗的成功率,最好將IPCR的擴增長度限制在2-3kb

應用

反轉錄PCR對克隆側翼未知DNA序列快速有效,是常規PCR技術的重要補充,是分子生物學技術的重要方法之一。IPCR在分子生物學研究中應用廣泛,可以檢測病毒、轉座子[1]等在基因組中的整合位點,克隆基因的鄰接序列以及建立基因組步移[2]文庫等。雖然該技術目前存在一定的缺陷(如基因組的復雜度、擴增的長度等有一定的限制),但隨著分子生物學技術的發展,必將會得到不斷的完善。

注釋:

[1] 轉座子:基因組中一段特異的具有轉位特異性的獨立DNA序列,可以從基因組中單獨復制或斷裂下來,環化后插入另一位點,并對其后的基因起調控作用。

[2] 基因組步移:通過一段已知序列探知其旁鄰的序列,并將探得的序列作為已知序列進一步探知其旁鄰序列的方法稱為基因組步移。

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