包涵體復性注意事項和常見問題解析

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包涵體復性注意事項

  1. 最適pH值范圍為8.0-9.0之間;
  2. 溫度適宜選擇4℃;
下載
  1. 復性時間一般為24-36小時;
  2. 低分子化合物 如L-Arg有助于增加復性中間產物的溶解度;脲、鹽酸胍、烷基脲、以及碳酸酰胺類等,在非變性濃度下是很有效的促進劑,都可阻止蛋白聚集;Tris對蛋白質復性有促進作用;EDTA可以防止蛋白降解;
  3. 首先要獲得較高純度的包涵體;
  4. 包涵體溶解要徹底,一般應使溶解液體量較大,不要怕蛋白被稀釋,要有助溶措施;
  5. 透析前后均要離心;
  6. 包含體要徹底洗滌干凈,洗滌液中加入適量Triton-X100;
  7. 包含體溶解后裝入透析袋在復性液中復性;
  8. 復性完畢在低濃度的緩沖液中連續緩慢透析12-24h ;
  9. 復性率的測定時要據變性蛋白和非變性蛋白的光學性質不同測定
  10. TritionX100、SDS這一類去垢劑最后不易去除,在制藥行業中一般不允許采用。用Triton洗滌有些包涵體效果不是很好。包涵體洗滌是純化極為重要的一步,改變培養條件,再洗滌包涵體,有時可以在上柱前已經只剩下3-4條雜帶,這樣后續的純化就很方便了。
  11. 復性時的蛋白濃度一般為0.1-1.0mg/ml,太高的濃度容易形成聚體沉淀,太低的濃度不經濟,而且很多蛋白在低濃度時不穩定,很容易變性。

包涵體復性常見問題分析

包涵體復性原則

低濃度,平緩梯度,低溫。

怎樣洗滌包涵體?

通常的洗滌方法一般是洗不干凈的,可以先把包涵體用6M鹽酸胍溶解充分,過濾除去未溶解的物質,注意留樣跑電泳,然后用水稀釋到4M,離心把沉淀和上清分別跑電泳,如此類推可以一直稀釋到合適的濃度,可以找到一個合適去除雜質的辦法,其實這就是梯度沉淀的方法,比通常的直接洗脫效果好。

對于尿素和鹽酸胍該怎么選擇

尿素和鹽酸胍屬中強度變性劑,易經透析和超濾除去。它們對包涵體氫鍵有較強的可逆性變性作用,所需濃度尿素8-10M,鹽酸胍6-8M。尿素溶解包涵體較鹽酸胍慢而弱,溶解度為70-90%,尿素在作用時間較長或溫度較高時會裂解形成氰酸鹽,對重組蛋白質的氨基進行共價修飾,但用尿素溶解具有不電離,呈中性,成本低,蛋白質復性后除去不會造成大量蛋白質沉淀以及溶解的包涵體可選用多種色譜法純化等優點,故目前已被廣泛采用。

鹽酸胍溶解能力達95%以上,且溶解作用快而不造成重組蛋白質的共價修飾。但它也有成本高、在酸性條件下易產生沉淀、復性后除去可能造成大量蛋白質沉淀和對蛋白質離子交換色譜有干擾等缺點。

8M尿素溶解的包涵體溶液應如何保存?

在4度放置半個月,都沒什么問題 。在室溫放置超過48小時,可能會對目的蛋白有影響,因為尿素在堿性條件下可使一些氨基酸酰基化,所以早些處理BI溶液比較好。

復性時的蛋白濃度

一般使用濃度為0.1-1.0mg/ml,太高的濃度容易形成聚體沉淀,太低的濃度不經濟,而且很多蛋白在低濃度時不穩定,很容易變性。

蛋白復性后濃度低

蛋白可能是在復性的過程中發生降解了。

可以將復性好的蛋白濃縮一下跑膠看看。復性過程一般都是低濃度蛋白,需要保證分子間有足夠的折疊空間。一些未正確折疊的蛋白就存在于沉淀中,可能沉淀看不出來,復性后的蛋白高速離心看看。

復性中蛋白析出是怎么回事?該怎么處理?

出現蛋白析出,肯定是條件變化太劇烈了。

復性應該采取復性液濃度和PH值逐漸變化的方法,例如根據包涵體的溶液成分,每隔1個PH或濃度值配置一種溶液,逐步透析到正常。此外透析時必須濃度極低,條件溫和,使蛋白質能夠正確折疊。但是復性的比率應該很低。

若加變性劑尿素可加到2M,鹽酸胍可加到1-1.5M;

另外可將甘油濃度增加,范圍可在≤30%,且在復性樣品中也可加適量甘油。

復性效果的檢測

根據具體的蛋白性質和需要,可以從生化、免疫、物理性質等方面對蛋白質的復性效率進行檢測。

  1. 凝膠電泳:一般可以用非變性的聚丙烯酰胺凝膠電泳可以檢測變性和天然狀態的蛋白質,或用非還原的聚丙烯酰胺電泳檢測有二硫鍵的蛋白復性后二硫鍵的配對情況。
  2. 光譜學方法:可以用紫外差光譜、熒光光譜、圓二色性光譜(CD)等,利用兩種狀態下的光譜學特征進行復性情況的檢測,但一般只用于復性研究中的過程檢測。
  3. 色譜方法:如IEX、RP-HPLC、CE等,由于兩種狀態的蛋白色譜行為不同。
  4. 生物學活性及比活測定:一般用細胞方法或生化方法進行測定,較好的反映了復性蛋白的活性,值得注意的是,不同的測活方法測得的結果不同,而且常常不能完全反映體內活性。
  5. 黏度和濁度測定:復性后的蛋白溶解度增加,變性狀態時由于疏水殘基暴露,一般水溶性很差,大多形成可見的沉淀析出。
  6. 免疫學方法:如ELISA、WESTERN等,特別是對結構決定簇的抗體檢驗,比較真實的反映了蛋白質的折疊狀態。

變性的融合蛋白可以制備多抗或者單抗嗎?

變性蛋白只是天然蛋白伸直的了產物,用來免疫動物具有更強的抗原性。只是天然蛋白中被包在內部的抗原決定簇也會暴露出來,如果用該變性抗原制備的抗體來檢測變性抗原是可以的,如果用來檢測天然蛋白,可能會有假陽性。做單抗也可以,同樣道理,篩選出的單抗可能對抗的抗原決定簇處于天然抗原的內部,是否能用還要看將來該單抗用來干什么。

純化后的可溶性融合蛋白可以直接用于制備多抗嗎?

免疫動物要求抗原體種盡量小。在這種小體積的情況下,緩沖液里的小分子成分只要沒毒影響就不大,可以不用考慮。

更多有關包涵體蛋白復性的技術操作和原理,請訪問包涵體蛋白復性的方法簡介與操作

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