原核蛋白可溶性表達策略及實驗方案

可溶性表達策略

大腸桿菌根據表達部位的不同可將蛋白表達的形式分為3種:第1種為胞外分泌,即目的蛋白被分泌到培養基中。這種方式表達的蛋白容易純化,不易降解,但通常只有少量的蛋白質可以分泌到細胞外;第2種為周質空間表達,這種方式表達的蛋白存在于周質間隙中,外周質的
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氧化環境有利于蛋白質的正確折疊,在向外周質轉移的過程中,信號肽在細胞內剪切,更有可能產生目的蛋白的天然N末端;第3種為胞內表達,這種表達易形成無活性的包涵體,需要經過繁瑣的變性、復性過程才能得到有活性的蛋白。
因為多數蛋白不能夠進行分泌表達,且表達量較少,所以分泌蛋白表達方法很少被使用;現階段實驗科研中常用的方法是融合型蛋白表達,包括蛋白上清表達和包涵體復性,以上倆種方法均可獲得大量的可溶性蛋白。有關通過蛋白復性獲得可溶性蛋白請參見《包涵體蛋白復性的方法操作》,這里主要從條件優化的角度討論第一種方法。

降低重組蛋白合成的速率

可溶性蛋白的產率取決于蛋白的合成速率,蛋白的折疊速率,以及聚集的速率。高水平表達時,肽鏈聚集的速率一旦超過折疊速率,就會形成包涵體。因此,降低重組蛋白合成的速率有利于提高重組蛋白的可溶性表達。常用的方法有培養溫度的優化、挑選合適的啟動子、誘導劑和誘導條件的優化等。

密碼子優化

密碼子的使用對外源基因的表達水平有重要的影響。密碼子優化就是根據表達系統對密碼子的偏好性進行優化篩選。經過優化的基因序列往往能提高mRNA二級結構的穩定性,有利于新生肽段的正確折疊,提高外源活性蛋白的表達。值得注意的是,稀有密碼子存在通常會對蛋白表達產生負面影響,在轉錄過程中稀有密碼子的位置以及轉錄的速率都會影響密碼子的翻譯,但在某些基因中使用稀有密碼子則能顯著降低肽鏈的延伸速率。

啟動子的選擇需要從啟動子強度、漏表達程度、誘導性及經濟因素等方面考慮。在胞內表達中,常采用T7、PL等強啟動子,表達水平可達菌體總蛋白的70%。若重組蛋白多以包涵體形式存在,可采用強度較弱的lac等啟動子以達到一個與表達能力相匹配的翻譯速率。(資料查看:基因表達密碼子優化

表達溫度的選擇

大腸桿菌的最適生長溫度在37~39℃之間,但此溫度下極易生成包涵體蛋白,降低可溶性蛋白的表達,而低溫培養條件下表達外源蛋白能有效地增加可溶蛋白的比例。

溫度對外源蛋白在大腸桿菌中的影響

由表可知:不同的外源蛋白低溫表達時,可溶性蛋白的表達水平有明顯提高。但培養溫度有一定下限(8~10℃),在此溫度以下,蛋白基本上停止表達。降低培養溫度有利于重組蛋白合成速率的降低,因為蛋白質的合成較慢,新合成的蛋白質會有更充分的時間折疊,增加蛋白的正確折疊率的同時降低重組蛋白的降解速率。

培養基的組成

培養基的組成對可溶外源蛋白的表達有顯著影響。一般情況下,蛋白表達采用合成培養基,但合成培養基往往又存在菌體生長較慢和菌體濃度較低的問題。外源蛋白的表達顯著地受葡萄糖濃度的影響,在誘導表達時期,需盡量保持低水平的葡萄糖,可以用甘油代替葡萄糖作為表達外源蛋白的碳源是解除葡萄糖效應的有效途徑之一。在誘導時期,流加營養物質也有可能顯著提高可溶蛋白表達。考慮以下幾點也可以提高可溶性蛋白的表達量:

  1. 向培養基中添加蛋白抑制劑也能提高可溶蛋白量;
  2. 外源蛋白二硫鍵的形成是一個酶依賴性反應過程,向培養基中添加適量的金屬離子,可能提高這些酶類的活性,因此也能增加可溶蛋白的表達量;
  3. 某些外源蛋白的活性和穩定性與某些金屬離子密切相關,因此向培養基中添加外源蛋白所需金屬離子也可能提高蛋白的可溶性和穩定性;
  4. 良好的通氣能有效降低培養基中對菌體表達蛋白有重要影響的CO2和乙酸的濃度,也有可能獲得高產量的活性蛋白;
  5. 培養基的pH值也會對可溶蛋白的表達產生重要影響,需要根據菌體和目的蛋白的特點選擇合適的pH值。

誘導條件優化

誘導時間和誘導劑的用量也是控制可溶性外源蛋白表達的重要因素。

誘導劑種類及其濃度都會對外源蛋白表達產生重要影響,應根據所采用的表達系統(比如啟動子的強弱)和外源蛋白的特點優化選擇。搖瓶培養時,應選用低菌體濃度誘導,因為在低菌濃度下菌體處于對數生長期,生長活躍,有利于表達可溶性蛋白。然而,如果能保證合理的補料與充分的通氣,在較高菌濃度下誘導也同樣可能獲得可溶蛋白的高效表達。在某些情況下,誘導劑的流加能顯著提高可溶蛋白的表達水平。

與分子伴侶或折疊酶共表達

分子伴侶的功能主要是通過阻止或校正不合理的疏水結合來幫助肽鏈形成正確的三維結構。

大腸桿菌的分子伴侶是由2個類型的蛋白質構成的,分別是Hsp60蛋白和Hsp10蛋白,二者都包含疏水區域,這些區域可與未折疊或錯誤折疊的多肽鏈結合,經過一個依賴ATP的過程幫助蛋白正確折疊。將幾種分子伴侶同時表達,有可能獲得比單獨使用更好的效果。需要注意的是,共表達分子伴侶應根據重組蛋白自身的特點進行選擇。還有一個需要考慮的是培養溫度,溫度可能會對共表達分子伴侶的效果產生重要的影響。

案例介紹——可溶性蛋白條件優化

一、目的蛋白是否表達

  1. 挑取一單菌落接種于含氨芐(Amp,終濃度為100g/mL)的3mL 液體LB 培養基中37℃,250rpm 培養過夜;
  2. 將過夜培養菌液以1:100 轉接于含上述抗生素的100mL 液體LB 中,37℃,250rpm,3.5h(大量培養至OD600=0.6 左右);
  3. 取出1 mL 菌液為未誘導的電泳對照,剩余培養液加入誘導物IPTG 至終濃度為1 mmol/L,繼續振蕩培養4h;
  4. 以未誘導菌液與IPTG 誘導后菌液作對比,SDS-PAGE 檢測。結果如下:

可溶蛋白表達案例一

1:pET-32aA3未誘導,2:pET-32aA3未誘導,3:pET-32aA3誘導后,4:pET-32aA3誘導后

由圖可知,目的蛋白經IPTG誘導后明顯表達,分子量約為35kd。

二、表達的情況,是可溶還是沉淀

  1. 將上述的37℃誘導菌液離心(4℃,12000g,5min),棄上清(LB 培養液),沉淀重懸于0.9% NaCl 溶液洗菌;
  2. 將重懸于0.9% NaCl 的菌體溶液離心(4℃,12000g,5min),棄上清(0.9% NaCl 洗菌液),得菌體,稱菌體重量,重懸于8mL PBS(pH 7.0)緩沖液,緩沖液用量根據50~100mg/mL 的菌液終濃度;
  3. 超聲破菌:冰浴條件下,超聲波破碎大腸桿菌,超聲設置如下功率:400W, 工作:15s, 間隔:45s, 全程時間:30min(30 次左右)以菌液由白變透明,且不粘稠為依據;
  4. 將超聲波破碎的菌液離心(4℃,12000g,15min),分別收集上清和沉淀,各取1mL,加入1mL 2×上樣緩沖液,沸水浴10min,SDS-PAGE 檢測。

可溶蛋白表達案例二

1: pET-32aA3 誘導上清,2: pET-32aA3 誘導沉淀

由上圖可知,目標蛋白在上清也有表達,即存在可溶性的表達,但是量很少,大部分也包涵體的形式存在(沉淀中),而包涵體的存在也證明了蛋白表達量很高,上清可溶蛋白的可操作性等因素都優于對包涵體蛋白的分離純化,所以可通過探索可溶表達條件,最終來加大上清蛋白的含量,以利于下一步實驗的進行。

三、探索可溶表達條件

影響包涵體形成的因素有很多,如誘導溫度,誘導時間,IPTG誘導表達濃度,搖床轉速等等,所以設定在低IPTG濃度下(0.1 mmol/L),在不同溫度,誘導時間下的表達對照:

  • 37℃ 250rpm 5h
  • 30℃ 180rpm 10h
  • 23℃ 90rpm 30h

過程:挑取一單菌落接種于含氨芐(Amp,終濃度為100g/mL)的3mL 液體LB 培養基中37℃,250rpm 培養過夜。將過夜培養菌液以1:100 轉接于含上述抗生素的50mL+50mL+60mL 液體LB 中,37℃,250rpm,3.5h(大量培養至OD600=0.6 左右)。從60mL 培養液中取10mL作為未誘導對照,標記3 個50mL LB 培養菌液:

  • 37℃ 250rpm 5h
  • 30℃ 180rpm 10h
  • 23℃ 90rpm 30h

都分5次取樣:

  • 37℃ 每一小時取樣一次(取10mL)編號為:371、372、373、374、375
  • 30℃ 每二小時取樣一次(取10mL)編號為:301、302、303、304、305
  • 37℃ 每五小時取樣一次(取10mL)編號為:231、232、233、234、235

誘導培養結束后,將上述樣品分別破菌離心,得上清與沉淀,加2× 上樣緩沖液,沸水浴10min,SDS-PAGE 檢測。

SDS-PAGE 檢測:

    • 37℃ M 1 2 3 4 5 五個樣的上清和沉淀
    • 30℃ M 1 2 3 4 5 五個樣的上清和沉淀
    • 23℃ M 1 2 3 4 5 五個樣的上清和沉淀

例:23℃條件下五個樣的上清和沉淀選取與編號

可溶蛋白表達案例三

1: 231 上清,2: 231 沉淀,3: 232 上清,4: 232 沉淀,5: 233 上清,6: 233 沉淀,7: 234 上清,8: 234 沉淀,9: 235 上清,10: 235 沉淀

  • 通過實驗測定,選取不同溫度下的最優可溶表達做比較(234,303,373),結果如下:

可溶蛋白表達案例四

1: 234 上清,2: 234 沉淀,3: 303 上清,4: 303 沉淀,5: 373 上清,6: 373 沉淀

最終經過比對,確定23℃條件下,明顯的提高了上清目的蛋白的含量,并且存在可溶表達平衡。20個小時后,蛋白表達將以包涵體的形式存在,即不論如何改變條件,可溶表達已經達到極限。所以無需探索更低溫度等條件。

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