磁珠蛋白純化流程

蛋白親和純化介紹 常見的蛋白純化技術
磁珠蛋白純化流程主要包括四大步:緩沖液準備,樣品制備,磁珠準備,目的蛋白純化。

緩沖液的準備

緩沖液可使用下列推薦緩沖液,也可根據自己的使用習慣配置不同的緩沖液體系,基本原則就是低咪唑上樣,高咪唑洗脫,或者高pH上樣,低pH洗脫。緩沖液在使用前最好用0.22 μm或者0.45 μm濾膜過濾除菌。因為Ni-IDA Magnetic Beads可以用于可溶性蛋白和包涵體蛋白的純化,兩種方法所需緩沖液不同,具體配置方法見下表。

名稱 體積 配方
結合緩沖液 1L 50 mM Tris (6.06 g Tris)
300 mM NaCl (17.53g NaCl)
20 mM Imidazole (1.36g imidazole)
使用HCl溶液調節pH至8.0,
使用0.22或者0.45 μm濾膜過濾除菌。
清洗緩沖液 1L 50 mM Tris (6.06 g Tris)
300 mM NaCl (17.53g NaCl)
20 mM Imidazole (1.36g imidazole)
使用HCl溶液調節pH至8.0,
使用0.22或者0.45 μm濾膜過濾除菌。
洗脫緩沖液 1L 50 mM Tris (6.06g Tris)
300 mM NaCl (17.53g NaCl)
300 mM Imidazole (20.4g imidazole)
使用HCl溶液調節pH至8.0,
使用0.22或者0.45 μm濾膜過濾除菌。

表1:可溶性組氨酸標簽蛋白純化所需緩沖液及配方

上述緩沖液體系適用于多數組氨酸標簽蛋白的純化,在結合緩沖液中添加一定濃度的咪唑可以降低非特異性結合,提高目的蛋白的純度。初次使用的客戶,可以采用推薦的緩沖液,再根據實驗結果進行調整緩沖液中的咪唑的濃度。

名稱 體積 配方
結合緩沖液 1L 50 mM Tris (6.06g Tris)
300 mM NaCl (17.53g NaCl)
8 M Urea (480.50 g Urea)
使用HCl調節pH至8.0,
使用0.22或者0.45 μm濾膜過濾除菌。
清洗緩沖液 1L 50 mM Tris (6.06g Tris)
300 mM NaCl (17.53g NaCl)
8 M Urea (480.50 g Urea)
使用HCl溶液調節pH至8.0,
使用0.22或者0.45 μm濾膜過濾除菌。
洗脫緩沖液 1L 50 mM Tris (6.06g Tris)
300 mM NaCl (17.53g NaCl)
8 M Urea (480.50 g Urea)
300 mM Imidazole (20.4g imidazole)
使用HCl溶液調節pH至8.0,
使用0.22或者0.45 μm濾膜過濾除菌。

表2:包涵體組氨酸標簽蛋白純化所需緩沖液及配方

樣品制備

細菌或酵母表達的蛋白

蛋白表達培養結束后,將培養液轉移到離心杯中,離心收集菌體,然后按料液比1:10~20加入結合緩沖液,在破碎前加入1 mM PMSF、去污劑1%Triton? X-100和還原劑1 mM TCEP(同時也可加入其他蛋白酶抑制劑,但不能影響目的蛋白與樹脂的結合)。將菌體沉淀懸浮起來,混勻,放置于冰浴中,然后冰上超聲破碎細胞,直至菌液基本澄清。將澄清的破碎液轉移至離心管中,離心。取上清,置于冰上備用或-20度保存。

酵母、昆蟲和哺乳動物細胞分泌表達可溶性蛋白

將細胞培養液轉移至離心杯,離心收集菌體和上清液,如上清液中不含EDTA、組氨酸和還原劑等物質,即可直接加入磁珠使用;如含有EDTA、組氨酸和還原劑等物質,需用結合緩沖液,4℃下透析后才能加入磁珠。對于大量體積的上清,需加入硫酸銨沉淀濃縮后,蛋白還需用結合緩沖液,4℃透析后才能使用。

磁珠準備

磁珠準備

用戶需要根據目標蛋白的表達情況確定菌體、細胞或上清液與磁珠用量的比例。下表以純化2 mg目標蛋白的純化為例,20%磁珠懸液用量為0.2~0.5 mL。

目標蛋白量 樣品體積 20%磁珠懸液用量
2 mg 10 mL 0.2~0.5 mL

將Ni-IDA Magnetic Beads充分混勻,使用移液器取適量的磁珠懸浮液,置于離心管中,將離心管置于磁分離器上,待溶液變澄清后,用移液器吸棄上清液。

磁珠平衡

再將離心管從磁分離器上取下來,加入0.5 mL的結合緩沖液,使用槍頭反復吹打5-10次,將離心管置于磁分離器上,待溶液變澄清后,用移液器吸棄上清液,重復上述步驟2次。

目的蛋白純化

磁珠結合目的蛋白

將破碎液加入到平衡好的磁珠中,顛倒混勻。將離心管置于混合儀上,置于4℃下孵育1h。

洗雜

將離心管置于磁分離器,待溶液變澄清后,用移液器移出上清液,保留,以備取樣檢測。向離心管中加入1 mL的清洗緩沖液,使用槍頭反復吹打5-10次,將離心管置于磁分離器上,待溶液變澄清后,用移液器吸取上清液,保留,以備取樣檢測。重復上述步驟2次。

洗脫

目標蛋白可以根據需要改變洗脫體積從而調整洗脫下的目標蛋白濃度。建議將1 ml洗脫緩沖液加入到離心管中,使用移液器輕輕吹打3-5次,混勻,將離心管置于磁分離器上,待溶液變澄清后,用移液器吸取上清液,即為目的蛋白組分。如有需要,可以重復上述步驟2-3次,以提高目的蛋白的回收量。

磁珠后處理

  • 向裝有磁珠的離心管中加入2 ml洗脫緩沖液,用移液器反復吹打3-5次,使磁珠充分懸浮,然后,置于磁分離器,吸棄上清液,重復該操作2次。
  • 向該離心管中加入2 ml去離子水,用移液器反復吹打3-5次,使磁珠充分懸浮,然后,置于磁分離器,吸棄上清液,重復該操作2次。
  • 加入20%的乙醇溶液,使總體積等于初始磁珠懸浮液的體積,保存于2-8 ℃。

SDS-PAGE 檢測

將使用純化產品得到的樣品以及原始樣品使用SDS-PAGE 檢測純化效果。

磁珠再生

組氨酸標簽蛋白親和純化磁珠所帶的鎳離子不需要經常螯合去除和重新掛鎳離子。當磁珠載量明顯變低時,需要進行對磁珠進行鎳離子剝離和重新掛鎳離子,也就是再生。按照下面操作流程進行鎳離子剝離和重新掛鎳離子。

  • 使用50 mM Tris-HCl(pH8.0)溶液(含6 M Gua-HCl)清洗2倍柱體積;
  • 使用去離子水清洗5倍柱體積;
  • 使用0.1% SDS清洗3倍柱體積;
  • 使用去離子水清洗5倍柱體積;
  • 使用70%乙醇清洗5倍柱體積;
  • 使用去離子水清洗5倍柱體積;
  • 使用100 mM EDTA (pH 8.0)清洗5倍柱體積;
  • 使用去離子水清洗5倍柱體積;
  • 使用100 mM NiSO4清洗5倍柱體積,與填料混合,于搖床中15℃,100rpm孵育過夜;
  • 使用去離子水清洗10倍柱體積;
  • 再生的磁珠結束后,可以立即使用,如不立即使用,需要將填料懸浮于等體積的20%乙醇中,置于2-8 °C保存。

流程優化

以上操作流程適用于大部分組氨酸標簽蛋白的純化,根據目標蛋白與金屬螯合磁珠的結合性能不同,用戶可以從以下幾個方面對純化流程進行優化,以提高目標蛋白的回收率和純度。
1、提高目標蛋白回收率的參考方法:

  • 降低樣品中的咪唑濃度;
  • 樣品中添加表面活性劑等物質;
  • 添加合適的蛋白酶抑制劑,防止目標蛋白降解;
  • 增加磁珠用量;
  • 延長蛋白與磁珠孵育的時間;
  • 提高洗脫緩沖液中的咪唑濃度;
  • 延長洗脫目標蛋白的時間或增加洗脫次數。

2、提高目標蛋白純度的參考方法:

  • 提高樣品中的咪唑濃度;
  • 向樣品中添加表面活性劑等物質;
  • 添加合適的蛋白酶抑制劑,防止目標蛋白降解;
  • 延長洗滌的時間,增加洗滌次數;
  • 采用梯度咪唑濃度洗脫目標蛋白。
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