基因合成的原理與應用

摘要:基因合成是體外合成雙鏈DNA的一種方法,是獲取目的基因的手段之一,本文主要介紹了不同獲取目的基因的方法及基因合成的原理、應用與優勢。

下載

人工合成基因出現在上世紀60年代,通過基因合成,可以獲得自然界中不存在的基因。目前,獲取目的基因的方法主要有三種:逆轉錄,PCR擴增,人工合成 。逆轉錄法主要適用于獲得分子量較大的未知序列的基因,它以目的基因的mRNA為模板,設計上下游引物,借助逆轉錄酶合成堿基互補的DNA鏈(即cDNA),在DNA聚合酶的作用下合成cDNA,即目的基因的雙鏈DNA。PCR主要適用于已知序列的擴增,獲得大量的目的片段,供人們肉眼觀察(RT-PCR可實現對起始模板的定量分析)。人工合成法就是采用化學合成的方法獲取目的片段,化學合成準確率較高,速度較快,同時根據不同的下游應用和密碼子的偏愛性,設計基因序列,提高表達水平。

原理

DNA合成的方法主要采用固相亞磷酰胺三酯法,運用此方法的DNA合成儀有很多,常用的有ABI 394合成儀、ABI39OO高通量合成儀,它們的區別主要在合成效率,試劑用量,耗時等方面,合成的原理是相同的,合成原理如圖:

基因合成

Step 1:DMTro是5’羥基的保護基團,用TCA(三氯乙酸)和預先連接在固相載體(CPG)上的核苷酸的5’端發生反應,脫去DMT,使5’羥基端游離

Step 2:亞磷酰胺保護的dNTP和活化劑四氮唑混合,得到核苷亞磷酸活化中間體,此時3’端被活化,5’-羥基被DMTro保護

Setp 3:1、2步的產物發生縮合反應偶聯,形成新鍵C-亞磷酯鍵

Setp 4:1中會剩下部分未參與反應的5’-羥基,通過乙酰化的方法封閉5’-羥基

Setp 5:3步形成的C-亞磷酯鍵不穩定,易被水解,所以用氧化劑碘將其氧化成更穩定的磷酸三酯鍵

通過以上步驟,一個脫氧核苷酸被連接到固相載體上,將其5’端的DMTro切除,重復以上步驟合成所有需要的堿基,最后經過氨水高溫處理,將合成的鏈從固相載體CPG上切下來,根據不同的下游應用純化處理后保存。

PCR擴增簡單方便,但不能保證基因序列的完全正確性,擴增存在突變風險,且PCR對模板也具有一定的要求,因此適用性存在局限性,相對于此基因合成具有如下優勢:

優勢

  1. 可以保證基因序列的完全正確性,無突變
  2. 合成周期短
  3. 不受模板來源限制
  4. 根據不同應用,設計優化基因序列,提高表達水平

應用

人工基因合成具有極大的靈活性,根據需求自行改變設計序列

  1. 進行基因優化,提高基因表達
  2. 合成已知序列的難擴增基因
  3. 合成大量用于微芯片的cDNA
  4. 克隆人鼠抗體或重組抗體
  5. 設計合成基因疫苗、基因治療載體
  6. 根據基因的結構功能研究,修改設計基因
  7. 合成不同的基因突變株、SNPS、或其它突變株
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