大腸桿菌蛋白表達感受態細胞的制備

大腸桿菌蛋白表達SOP

本文主要講述了大腸桿菌蛋白表達實驗中感受態細胞制備實驗流程和原理
下載

感受態細胞的概念

感受態,是指宿主細胞最容易接受外源基因并實現將其轉化的一種生理狀態,它是由受體菌的遺傳性狀所決定的,同時也受菌齡以及外界環境因子的影響, 比如Ca2+就可以大大促進轉化的作用。細胞的感受態一般出現在對數生長期,新鮮幼嫩的細胞是制備感受態細胞和進行成功轉化的關鍵。

感受態細胞制備的原理

制備感受態細胞最常用的方法是用預冷的CaCl2處理對數生長期的細菌,即用低滲CaCl2溶液在低溫(0℃)時處理快速生長(進入對數生長期)的細菌,從而獲得感受態細胞。此時細胞膨脹成球形,外源DNA分子在低溫條件下易形成抗DNA酶的羥基-鈣磷酸復合物粘附在細胞表面,通過熱激處理促進細胞對外源DNA分子的吸收。轉化效率非常高。此方法的關鍵在于選用的細胞必須處于對數生長期,實驗操作必須在低溫無菌環境下進行。

大腸桿菌感受態細胞的制備實驗

1、實驗儀器及試劑

  • 儀器:超凈工作臺,搖床,高壓滅菌鍋,培養箱,制冰機,超低溫冰箱,離心機,接種環,試管,搖瓶(2L),平板,移液槍,槍頭,離心管(500mL),EP管(1.5mL),藍蓋瓶,泡沫箱
  • 試劑:CaCl2溶液:PIPES 1.51g,CaCl2?2H2O 4.41g,甘油 75ml,pH=7.0,定容至500ml。

LB培養基(固體、液體):Tryptone 1.00g,Yeast 0.50g,NaCl 1.00g,定容至100ml。(固體培養基加入1.5%的瓊脂)

抗性:卡那霉素,氨卞青霉素,氯霉素,四環素。

  • 材料:感受態菌株

2、 實驗方法及操作步驟

  • 取-80℃凍存的感受態菌株,用接種環劃線分離接種于固體平板上(平板抗性根據感受態選擇),做好標記,倒置于37℃培養箱培養過夜。
  • 第二天,從平板上挑取單個菌落,接種至含有4ml LB培養液(抗性根據感受態選擇)的試管中,37℃,195rpm,震蕩培養過夜。次日取菌液4ml接種至含有400ml LB培養基(抗性根據感受態選擇)的2L搖瓶中,37℃,200rpm震蕩培養約2-3小時。
  • 當菌落OD600nm值達到0.3-0.5時,將搖瓶取出放置于冰上10-15min。在無菌條件下把菌液倒入500ml的預冷的離心管中,離心4℃,3000r,8min。
  • 棄去上清,加入約200ml的預冷的CaCl2溶液,吹打混勻,懸浮菌體,放入冰浴30min。
  • 離心4℃,3000r,8min,棄去上清,加入約8ml預冷的CaCl2溶液,重新懸浮菌體。
  • 將用CaCl2溶液處理后的菌體分裝于1.5ml的EP管中,每管110ul,保存于-80℃的超低溫冰箱中。

感受態細胞測試

隨機取1支本次制備的感受態細胞,轉化一個以前轉化成功的質粒,從轉化平板上的菌落數及表達鑒定的SDS-PAGE電泳圖(看是否出現其他的雜帶及蛋白表達情況)判斷感受態的效價。如果效價好,這批感受可以用;否則,要重新制備。

注意事項

1、每次取感受態細胞時,注意查看庫存,保證庫存不低于15支,少于15支時要及時制備。

1、菌株生長在對數時進行CaCl2處理。

2、全程操作要【低溫無菌】。

3、用CaCl2溶液懸浮菌體時要均勻,不要有塊狀。

4、常用感受態細胞的選擇抗性:BL21(DE3)無抗性;BL21 Codon plus(DE3)具有氯霉素抗性;OrigamiB(DE3)具有卡那霉素抗性,不能用于具有卡那霉素抗性質粒的表達;BL21(DE3)plysS具有氯霉素抗性;Rosetta(DE3具有氯霉素抗性;Shuffle具有鏈霉素抗性或不用抗性。

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