Fret熒光共振能量轉移

對于分子生物學來講,生物分析手段的發展,是闡明機理的必要條件。下載在研究分子間相互作用的道路上,人們不斷探索,總結出很多方法,免疫技術,晶體衍射,核磁共振等。1948年,熒光共振能量轉移(Fluorescence resonance energy transfer,FRET)理論被首次提出,它可以測定1.0-6.0nm距離內分子間的相互作用。1967年,這一理論得到了實驗驗證,將1.0-6.0nm的距離稱為光學尺。二十世紀八十年代出,通過科學家的不斷探索,Fret技術成功運用到蛋白質結構的研究中。自Fret熒光共振能量技術誕生以來,已結合多種先進的技術和方法,如電子顯微鏡,X射線衍射等,推動了分子生物學檢測手段的發展。

作用原理

熒光共振能量轉移技術,是采用物理方法去檢測分子間的相互作用的方法。他適用于在細胞正常的生理條件下,驗證已知分子間是否存在相互作用。此方法的檢測原理如下;fret-yl

將我們要檢測的蛋白(如圖X和Y),分別偶聯上D和A熒光蛋白,D和A是一對熒光物質,我們稱之為供體(donor)和受體(acceptor)。當用430nm的紫光去激發X融合蛋白時,它能夠產生490nm的藍色熒光;同樣,當我們用490nm的藍光去激發Y融合蛋白時,它能夠產生530nm的黃色熒光。(結合圖1) 。

當蛋白X和Y間沒有相互作用時(兩者的空間距離>10nm),融合蛋白X和Y分別產生相應的熒光而被檢測到,fret-jh如果蛋白X和Y間存在相互作用(兩者的空間距離需<10nm,結合圖2),用紫光激發融合蛋白X其產生的藍光會被融合蛋白Y吸收,從而產生黃色熒光,這時,在細胞內將檢測不到藍色熒光的存在。這時因為能量從X融合蛋白轉移到了Y融合蛋白,這就是熒光共振能量轉移技術。

技術難點

一個理想的Fret相互作用體系,要求要有一對合適的熒光物質, 即供體的發射光譜與受體的吸收光譜有明顯的重疊。且當供體的激發波長時對受體無影響,供體和受體的發射光譜要完全分開,否則容易造成光譜干涉,而使反應體系不穩定。目前,較為常用的供體-受體分子對,主要有綠色熒光蛋白類(GFPs)和染料類。綠色熒光蛋白類有CFP-YFP,BFP-GFP,BFP-YFP等,染料類的有Cy3-Cy5,FITC-Rhodamine等。且這些熒光物質要能夠標記在研究對象上。

應用要求

  • 供體熒光基團和受體熒光基團的空間距離要<10nm;
  • 供體的發射光譜與受體的接收光譜有相當的重疊;
  • 供體、受體分子在量子產率、消光系數、水溶性、抗干擾能力等方面要求較高。

優缺點

優點 缺點
在活細胞的正常生理條件下進行檢測,觀察大分子在細胞內的構象變化與相互作用,并彌補了需破碎細胞檢測相互作用的缺點;
靈敏度高,可實現對單細胞水平的研究,研究單個受體分子;
可與多種儀器和技術結合使用,如顯微鏡,色譜技術,電泳,流失細胞技術等;
應用比較局限,一般需要在待檢測分子上偶聯熒光物質(加上標記);
對實驗要求較高,如供受體的光譜重疊不好,會導致熒光干擾,對供受體的抗干擾能力,水溶性等要求高;
需要不斷探索合適的供體和受體,且能夠標記分子;
難以觀察瞬時的分子間作用,檢測要求大量的樣品;

應用

  • 細胞內分子間的相互作用
  • 膜蛋白的研究
  • 細胞膜受體蛋白間的相互作用
  • 細胞凋亡的研究
  • 核酸檢測

實驗流程簡述

以熒光物質CFP(供體)-YFP(受體)為例,檢測AB蛋白在細胞內的相互作用。

  1. 細胞培養:根據實驗培養特定的細胞用于轉染,觀察檢測分子在細胞內的相互作用;
  2. 細胞轉染:構建質粒載體CFP-A和YFP-B,將檢測的AB蛋白分別偶聯上熒光蛋白CFP和YFP,并將兩個質粒共轉染到培養的細胞內;
  3. 檢測 FRET:質粒載體CFP-A和YFP-B轉染細胞 10h、12h、18h、24h、36h、48h、72h 后檢測,是否發生Fret;
  4. FRET圖像采集: 確定 FRET 配對的激發波長, 藍光被調諧分別用于探測最大和最小的供體和受體信號, 最大供體信號和最小受體信號對應的波長用于收集雙表達細胞的 FRET信號。調整激光變化,以便獲取最大 CFP 信號和最小 YFP 信號的激發光波長, 采集供體和受體圖像,收集 FRET 信號。每個細胞 FRET 檢測重復 3 次,每種轉染至少完成 6 個細胞的 FRET 檢測;
  5. FRET 數據處理: 去除 FRET 信號中 DSBT 和 ASBT 的光譜串色信號; 受體通路的FRET 信號需要對供體受體光譜靈敏度的變化進行矯正、對自發熒光和光學噪聲進行矯正; 利用矯正系數對雙標定細胞進行象素匹配矯正。

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