Far-Western Blot

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Far-western blot是一種檢測蛋白間相互作用的分子生物學方法。它可以驗證已知蛋白間的相互作用,或分析已知蛋白和未知蛋白間的相互作用。Far-Western blot技術與Western blot相似。在Western blot實驗中,用特異性抗體(一抗)去檢測膜上的蛋白,HRP標記的二抗與一抗結合,通過顯影觀察膜上的蛋白。而在Far western blot中,將靶蛋白固定在PVDF/NC膜上,用誘餌蛋白(已知蛋白)作為探針去檢測膜上的靶蛋白,再利用特異性抗體孵育、檢測,以此來分析靶蛋白和誘餌蛋白間的相互作用。

Far-western blot分析范圍

  • 分析已知蛋白間的相互作用;
  • 分析已知蛋白和未知蛋白間的相互作用;

Far-western blot的優缺點

優點:

  • 實驗重復性好;
  • Far-western blot可以一次對多個組織樣本進行分析;
  • 具有相互作用的蛋白的分子量可以立即確定;

缺點:

  • 實驗過程涉及多個洗滌步驟,弱相互作用很難被檢測到;
  • 如果靶蛋白在組織中含量低則相互作用很難被檢測到;
  • 實驗可能涉及蛋白變性及復性,無法檢測依賴于天然結構的相互作用。

實驗流程

Far-western blot實驗流程主要包括:①凝膠電泳;②轉膜;③封閉;⑥孵育;⑦檢測。下面對Far-western blot的實驗操作流程做系統介紹。
Far-western blot實驗流程

圖1:Far-western blot實驗流程

凝膠電泳

通過凝膠電泳將樣品中不同大小的蛋白分離開來。電泳可以用十二烷基硫酸鈉 – 聚丙烯酰胺凝膠電泳SDS-PAGE或天然PAGE分離。

轉膜

樣品中的蛋白在凝膠上分離后,將蛋白質從凝膠轉移到膜上。此步驟的目的為將蛋白附著到膜的表面,使蛋白變得易于探測。在轉膜的過程中需小心操作,避免污染問題。如果轉膜過程存在污染,則最終檢測結果會出現很高的背景。

封閉

轉膜結束后一般采用異源性蛋白質封閉整張膜,以阻塞非特異性結合位點。常用的封閉劑有脫脂奶粉、BSA等。需要說明的是,封閉劑有可能會發生交叉反應或者以其它的方式破壞待研究的蛋白相互作用,需要根據經驗確定合適的封閉劑。

探針孵育

將誘餌蛋白與封閉后的膜共孵育,使誘餌蛋白與NC膜上相互作用的蛋白結合,孵育后洗去未結合的誘餌蛋白。探針蛋白通常可以利用大腸桿菌表達系統生產出來,雖然細胞裂解液也可以作為探針蛋白,但是為了降低實驗背景,最好選擇純化的蛋白作為探針(誘餌蛋白的純度越高,實驗的成功率就越高)。

探針蛋白檢測

檢測探針蛋白的策略通常有以下幾種:

  • 未標記的誘餌蛋白→酶標記的誘餌特異性抗體→ 底物試劑
  • 放射性標記的誘餌蛋白→ 暴露于膠片
  • 生物素化的誘餌蛋白→ 酶標記的鏈霉抗生物素蛋白→ 底物試劑
  • 融合標記的誘餌蛋白→ 標簽特異性抗體→ 酶標記的二抗→ 底物試劑

實驗對照設置

為了提高結果的準確性,需要設置合適的實驗對照。例如,如果誘餌蛋白為GST-融合蛋白,則單獨設置一組GST標簽實驗組作為陰性對照,排除GST標簽本身與膜上的靶蛋白存在非特異性結合的可能性。

Far-western blot VS.Western blot

對比項目 Far-western blot Western blot
凝膠電泳 天然(通常)或變性 天然或變性(通常)
轉膜 PVDF膜/NC膜 PVDF膜/NC膜
封閉 脫脂奶粉/BSA 脫脂奶粉/BSA
檢測策略
  • 酶標記的誘餌特異性抗體
  • 放射性標記的誘餌蛋白
  • 生物素化的誘餌蛋白→酶標的鏈霉抗生物素蛋白
  • 融合標記的誘餌蛋白→一抗→酶標二抗
一抗→酶標二抗
實驗對照 需要 不需要

注意事項:
檢測標記時,通常用酶(辣根過氧化物酶或堿性磷酸酶)標記抗體。相比之下,誘餌蛋白不選用酶標記,因為大的酶標記可能在空間上阻礙誘餌和靶蛋白之間結合。

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