內毒素去除及內毒素檢測的實驗操作

原核蛋白表達服務中,細菌內毒素去除和內毒素檢測是比較重要的一個環節。本文詳細講解了內毒素去除及檢測的原理和操作方法,并附有相關問題解答。
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什么是細菌內毒素?

細菌內毒素系指細菌的死體或細菌代謝物,細菌內毒素的主要成份是產生于革蘭氏陰性菌(以革蘭氏陰性桿菌最多)?細胞外壁層的脂多糖類物質,其活性主要源于其結構中的類脂A。各種細菌的內毒素大致相同,可引起發熱、微循環障礙、內毒素休克及播散性血管內凝血等。涉及細胞和動物實驗時,一般對內毒素控制都有嚴格要求。

細菌內毒素具有很強的耐熱性和化學穩定性,100?℃以下無大變化,在120℃高溫下加熱4小時僅能破壞98%,要完全滅活需在180℃高溫下,加熱2小時以上,這樣的方法進行內毒素去除有相當難度。一般化學藥品不影響細菌內毒素的活性,只有強酸、強堿或強氧化劑可以破壞細菌內毒素。

內毒素去除

細菌內毒素去除的原理

因細菌內毒素體積小,耐熱性及化學穩定性強,所以一般的過濾、加熱和化學方法不易去除或滅活內毒素。現比較常用的內毒素去除方法多為超濾法或親和層析法。超濾膜孔徑(5~100nm)?的下限與細菌內毒素相近,所以可用小孔徑的超濾膜去除細菌內毒素。

內毒素去除實驗操作

親和層析內毒素去除的方法較復雜,具體操作如下:

  1. 樣品處理:樣品的pH值和離子強度在內毒素去除的過程中起著重要作用。雖然結合內毒素的pH?范圍在6-9,但是7-8?的pH?范圍是純化的最佳范圍。合適的離子濃度可以降低非特異性吸附,0.15-0.5M?NaCl?的條件可以得到一個很好的去除效率和低的樣品損失。所以,純化之前可以使用處理過的氯化鈉,0.1M?的氫氧化鈉或0.1M?鹽酸來調節離子強度或pH值。
  2. 活化樹脂:將預裝柱置于鐵架臺,垂直固定,去除預裝柱頂部的蓋子,打開流速控制器,使保護液在重力作用下流干,加入5ml?的再生緩沖液,調節流速控制器,保持流速在0.25ml/min(或者10?滴/min),待再生緩沖液流干,再加入5ml?再生緩沖液,再重復操作兩次,確保體系保持無熱原(即內毒素)存在。即使是第一次使用也必須進行這一步操作。這步操作大約需要60?分鐘完成。
  3. 平衡樹脂:活化完畢,加入6ml?的平衡緩沖液,調節流速控制器,保持流速在0.5ml/min,流干平衡緩沖液,再按此操作重復兩次。這步操作大約需要40?分鐘完成。
  4. 內毒素去除:將流速控制器關閉,使用無熱源槍頭將樣品加入,打開控制器,控制流速不高于0.25ml/min,流出液體積達到1.5ml?后,使用無熱源接收管接受樣品,樣品流干后,再加入1.5ml-3.0ml?的平衡緩沖液淋洗,收集淋洗液。檢測樣品濃度及內毒素水平。
  5. 再次使用:如果流出樣品內毒素水平未能達到預期值,需要將預裝柱重新再生,按照步驟1?重新再生,然后上樣純化。
  6. 保存條件:如果預裝柱用完后需要保存,先用10ml?平衡緩沖液平衡柱子,待平衡液流干,加入1.5ml?的再生緩沖液(含0.02%的疊氮化鈉)

內毒素去除親和填料的注意事項:

  1. 內毒素去除用的親和填料每次使用前都需用Buffer處理;
  2. 配制緩沖液要用無內毒素的注射級用水,配制過程要防止引入內毒素;
  3. 適當延長填料與樣品溶液的處理時間可以加大內毒素的吸附量;
  4. 如果用磁力攪拌要注意轉速別太快,避免攪碎填料;
  5. 樣品如果本身是帶負性電荷,為增加樣品回收率,樣品中可以加<0.2M?NaCl;
  6. 樣品pH可以在7-9范圍內;
  7. 樣品內毒素太高,超過填料處理量,需要稀釋樣品找到內毒素的范圍,和經內毒素去除后的范圍對照,就可以知道效果,如果一次去除不完全,可以重復,直到合格為止;
  8. 內毒素去除使用的親和填料保存條件為20%乙醇,4~8℃。

內毒素去除實驗常見問題:

問題 可能原因 解決方法
 

去除效率低

樣品的pH沒有在7-8之間 pH調至7-8之間
樣品和親和樹脂的接觸時間太短 降低樣品的流速或進行低溫孵育
去除系統受到外來因素干擾 使用無熱源的實驗儀器
內毒素與目的蛋白結合太牢固 1.增加樣品的pH,使它們解離

2.增加樣品與親和樹脂的接觸時間

 

樣品損失高

樣品通過非特異性作用結合在親和樹脂上 增加樣品與平衡緩沖液中NaCl的量
目的蛋白與內毒素結合牢固,一起結合在親和樹脂上 1.增加樣品的pH,使它們解離

2.增加樣品與親和樹脂的接觸時間

 

樣品被污染

樹脂處理過其他產品 盡量避免同一個預裝柱處理不同樣品;如果無法避免,建議

用10-20ml?2M?NaCl?淋洗樹脂,再處理其他樣品

內毒素檢測

內毒素檢測原理:利用鱟試劑能與內毒素產生凝聚反應的特點,來檢測內毒素的含量。

內毒素檢測流程圖
內毒素檢測流程圖
  1. 陽性樣品對照溶液的制備:將5MVD倍的樣品1.0ml與4λ濃度的內毒素標準溶液混合制成2λ濃度的內毒素溶液;
  2. 取8只鱟試劑,每支加入1mlBET(細菌內毒素檢查用水)溶解;
  3. 取其中兩支作為對照管分別加入0.1ml內毒素標準溶液,2支加入0.1ml混合制成2λ濃度的內毒素溶液,2支加入0.1mlBET作為陰性對照,2支加入0.1ml樣品,將8支試劑混勻,封口并放入37攝氏度恒溫水浴60min;
  4. 結果分析

① 陽性對照為陽性,陰性對照為陰性,樣品陽性對照為陽性,實驗成功;

② 若2支樣品管都為陽性,樣品不符合要求;若2支樣品管均為陰性,樣品符合要求;若分別為陰陽性,則需重新進行內毒素檢測,復試時做4支試劑管有一支為陽性則樣品不符合規定。

內毒素檢測的注意事項:

  • 鱟試劑是一種生物試劑,建議進行內毒素檢測時進行復核;
  • 內毒素檢測時稀釋所用的儀器不能交叉反復使用;
  • 嚴格控制內毒素檢測時的反應溫度和時間;
  • 鱟試劑應該在低溫下保存,雖然在溫熱的條件下鱟試劑還是相對比較穩定的,但是需要避免長時間的置于在高于25℃的溫度條件下。在內毒素檢測時用的鱟試劑一般只能凍融一次,復溶的鱟試劑需存放在2-8℃的冰箱內或-20℃以下保存。

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