競爭ELISA法測定抗體親和力

抗體親和力測定的方法很多,競爭ELISA法是一種簡便易行的親和力測定方法,下載本文主要介紹競爭ELISA法測定抗體親和力的原理、操作步驟以及注意事項。如果想了解更多抗體親和力的測定方法,查看抗體親和力測定方法介紹

原理

抗原抗體的結合是一個可逆的反應:A+B ?AB(A表示抗體,B表示抗原,AB表示抗原抗體結合物)。
當反應達到平衡時,解離常數Kd=[A][B]/[AB],[AB]表示反應平衡時抗原抗體結合物的濃度,[A]表示反應平衡時游離抗體的濃度,[B]表示反應平衡時游離抗原的濃度。
① 當反應體系中抗體很少,而抗原過量時,反應平衡后[AB]>[A];
② 當反應體系中抗原量很少,而抗體過量時,反應達到平衡后[AB]<[A];

③ 當反應體系中抗原抗體的量剛好合適時,反應達到平衡后處于半飽和狀態,此時[AB]=[A],則Kd=[A][B]/[AB]=[B]。

在半飽和狀態下,如果抗體的濃度很低,反應消耗的抗原很少,則反應后游離的抗原濃度[B]約等于總的抗體濃度[B],此時Kd=[B]≈[B]。因此,只要在抗體濃度較低的情況下,找到可以在反應平衡后達到半飽和狀態的抗原濃度[B],便可以得到解離常數。
競爭ELISA測抗體親和力原理

操作步驟

競爭ELISA法測出的Kd值的準確性,依賴于一個大前提:將反應混合物加入包被抗原板后,包被抗原與游離抗體的結合不會破壞抗原抗體反應體系的平衡狀態(如果抗原板中抗原濃度過高,結合的游離抗體超過了一定的量,抗原抗體反應體系的平衡會被破壞,此時測得的OD值偏大,最終導致結果偏大)。通常允許抗原板結合的最大游離的抗體量為10%。在進行ELISA法檢測抗體親和力實驗時,需要確保抗原不會破壞反應體系的平衡。通常可以用以下操作步驟來確定該包被抗原的濃度是否過高:

  • 包被抗原板,然后用3%的MPBS室溫封閉2h,PBS洗滌;
  • 準備梯度稀釋的抗體溶液(稀釋前的抗體濃度與競爭ELISA實驗中的抗體濃度相同),每個稀釋液取100mL;加入第一塊抗原板中,一式三份(見下圖a),孵育1個小時;
  • 使用微量移液器小心移出第一塊板中抗體稀釋液,將三份相同濃度的稀釋液放入一個管中,每個稀釋液取100mL加入第二塊抗原板中,一式兩份(見下圖b),孵育1個小時,PBS洗滌;
  • 加入酶標二抗,孵育1個小時,PBS洗滌;
  • 每個孔中加100μl底物,顯色30min;
  • 終止顯色反應,測定各個孔OD值;
  • 將得到OD值與對應的抗體濃度結合,分別就第一塊抗原板與第二塊抗原板做兩條擬合曲線(見下圖c);

競爭ELISA測抗體親和力預實驗流程

  • 對比兩條曲線,如果之間的差值小于10%,則說明該包被抗原的濃度符合要求,如果大于10%,則說明該包被抗原濃度過高,需對包被抗原進行稀釋后重新測定。

競爭ELISA測抗體親和力實驗流程

  1. 包被抗原板,然后用3%的MPBS室溫封閉2h,PBS洗滌。
  2. 在一排試管中,利用有限稀釋法建立從0.1 nmo/L~1μmol/L濃度梯度的抗原PBS溶液,加入抗體溶液(濃度≤0.5μmol/L)使總體積為100μl。
  3. 室溫孵育30min后,加90μl反應混合物到前述已包被抗原的微孔中,微孔中預先加人30%的MPBS 30μl后孵育,但時間不宜超過10min(時間不宜過長,過長會導致混合物中反應平衡體系被破壞,最終實驗數據不準確)。充分洗滌抗原板。
  4. 加入酶標二抗,孵育1h,PBS洗滌。
  5. 加入顯色底物顯色,顯色30min后加入終止液停止反應,進行OD值讀數。

抗原濃度較低時,反應平衡后[A]較大,被抗原板捕獲的游離抗體多,信號強;當抗原濃度高時,反應平衡后[A]較小,被抗原板捕獲的游離抗體少,信號弱;當抗原濃度髙到一定程度時,將沒有信號。在最強信號一半時的狀態為半飽和狀態,此時[A]=[AB],Kd=[B]≈[B]總。將測得的OD值記錄,結合梯度稀釋的抗原濃度繪制擬合曲線,最終找到最強信號一半的點,對應的抗原濃度即解離常數Kd

注意事項:

酶標抗體建議不要使用HRP偶聯抗體,競爭ELISA法測抗體親和力實驗是在抗體濃度很低的條件下進行,利用HRP偶聯抗體并不能很好的獲得信號。為了獲得更好的信號,建議使用AP偶聯的鼠單克隆抗體。
德泰提供抗體親和力檢測服務,可以準確的測定抗體的親和力。

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