免疫共沉淀常見問題解析

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  1. 免疫共沉淀中的input是指什么?
  2. 答:input是陽性對照。免疫共沉淀實驗中,會直接取細胞裂解液進行WB,用于驗證細胞裂解液中確實存在目的蛋白,即陽性對照。

  3. Co-ip實驗兩個抗體需要不同種源嗎
  4. 答:最好選擇兩個不同種源的抗體。選擇同一種源的抗體的問題在于:在WB之前進行的蛋白變性這一步,由于加樣緩沖液中含有巰基乙醇,巰基乙醇會把抗體的重鏈和輕鏈之間的二硫鍵破壞,從而使的抗體變成重鏈分子55KD和輕鏈分子25KD。假設你IP的抗體是兔抗的,目的蛋白進行WB的抗體也是兔抗的,而且目的蛋白的分子量為55KD,可以想象,55KD的位置除了你的目的蛋白以外,還有IP抗體的重鏈IgG。由于IP的抗體用量非常大(1ug),就導致55KD處的信號會非常強。如果你用抗兔的二抗進行顯色,那么55KD處的ip抗體的重鏈和你的目的蛋白會重疊在一起,無法分辨。
    然而這個時候如果你的目的蛋白進行WB的抗體不是兔抗的,比如小鼠抗的,那么就需要用抗小鼠的二抗進行顯色,而抗小鼠的二抗是無法跟兔抗的IP抗體發生反應的。因此55KD位置的IP抗體的重鏈IgG就無法顯色,發生反應的就是你的目的蛋白了。

  5. 免疫共沉淀如何避免假陽性?
  6. 答:若抗體濃度高,則降低抗體濃度;若抗體特異性不好,則換抗體;若PCR污染,則重新配置緩沖溶液。

  7. 免疫共沉淀中ProteinA/G瓊脂糖珠有何作用?
  8. 答:ProteinA/G能特異性地結合到免疫球蛋白的FC片段,因此能和抗體結合,而抗體與目標蛋白結合,目標蛋白和相互作用的蛋白結合。

  9. Co-ip實驗中使用的對照抗體有哪些?
    • 單克隆抗體:正常小鼠的IgG或另一類單抗;
    • 多克隆抗體:正常兔IgG
  10. 免疫共沉淀陰性對照的意義是什么?
  11. 答:排出污染的可能性,例如檢測一個兔子細胞的某種蛋白質,若沒有設置LgG的對照,而操作中有非特異性蛋白質,又和設計的抗體有作用,就會出現陽性的結果。如果做了陰性對照,也就是lgG對照,對照沒有出現陽性就說明沒有非特異性的蛋白,對照出現陽性,說明抗體有非特異結合的可能,需要重新開始實驗。

  12. Co-ip實驗中如何去除重鏈輕鏈的影響?
  13. 答:用兔的lgG做對照;用抗Fab和Fc抗體特異性封閉輕鏈和重鏈;在WB二抗上著手,這種二抗針對的是輕重鏈間的二硫鍵,若跑SDS膠,最后顯影是檢測不到重鏈和輕鏈的。

  14. 免疫共沉淀中沒有檢測到與目的蛋白相互作用的蛋白或檢測得到的信號太弱?
  15. 答:裂解液中的去垢劑濃度太高或配方過于劇烈:此時降低去垢劑濃度或更換去垢劑種類;
    受蛋白的亞細胞定位影響:應重新選擇裂解液配方來釋放目的蛋白;
    蛋白與蛋白之間的相互作用太弱或不太穩定:應選擇親和力更高的抗體以捕獲更多的目的蛋白,從而捕獲更多的相互作用蛋白;過表達提高目的蛋白的含量:選擇目的蛋白或相互作用蛋白含量高的樣品進行免疫共沉淀實驗。

  16. 免疫共沉淀與免疫沉淀的區別
  17. 免疫沉淀實驗免疫沉淀

    免疫沉淀(immunoprecipitation)是指利用抗體可與抗原特異性結合的特性,將抗原(常為靶蛋白)從混合體系沉淀下來,初步分離靶蛋白的一種方法。

    免疫共沉淀(coimmunoprecipitation)是一種在體外探測兩個蛋白分子間是否存在特異性相互作用的一種方法。其原理非常簡單,如果兩個蛋白在體外體系能夠發生特異性相互作用的話,那么當用一種蛋白的抗體進行免疫沉淀時,另一個蛋白也會被同時沉淀下來。與酵母雙雜交技術不同,免疫共沉淀技術所利用的是抗原和抗體間的免疫反應,是一種基于體外非細胞的環境中研究蛋白質與蛋白質的相互作用的方法。

    免疫共沉淀與免疫沉淀技術所使用的原理與方法大致相似,所不同的是,在免疫共沉淀中,對靶蛋白的結合與沉淀由另一個與之發生相互作用的蛋白替代。在免疫共沉淀或免疫沉淀的基礎上,通過進一步與其它技術的結合,如聚丙烯酰胺凝膠電泳,還可進一步對靶蛋白的的分子量等特性進行鑒定。

  18. Gst pull-down與免疫共沉淀的區別
    • 免疫共沉淀:利用抗原抗體反應的特異性;
    • GST Pull down:一般指用一個帶GST標簽的重組蛋白,與目的蛋白進行孵育,最后用結合GST的Beads拉下相互作用復合物;
  19. Co-ip實驗目的蛋白高背景產生的原因及處理方法
  20. 答:非特異蛋白結合,處理方法:在無血清培養液中裂解細胞; 在免疫沉淀前用protein (G/A)珠子預洗免疫沉淀后增加漂洗次數和嚴謹度(高鹽或去垢劑),裂解液嚴謹度太低,處理方法:改用高嚴謹度裂解液,實驗儀器或液體被污染,處理方法:使用潔凈的儀器或液體轉移膜上的非特異吸附,處理方法:戴手套, 用鑷子夾取, 不要接觸膜轉移面。

  21. 免疫共沉淀實驗失敗原因有哪些?
  22. 樣品被蛋白酶降解,處理方法:添加蛋白酶抑制劑(protease inhibitor);所有操作保持4℃以下冰上操作并防止凍融。
    抗體濃度太低,處理方法:調整IP和/或IB抗體濃度, 必要時設立濃度梯度,摸索最佳濃度;
    抗體親合力太低,處理方法:選用適合于IP和/或IB的相應抗體;
    IP抗體未與agarose珠子結合,處理方法:選用適合于IP的相應珠子, 正確保存防止變質或干燥;
    Tag未暴露在融合蛋白構象的表面,處理方法:改變tag融合表達部位;
    裂解液嚴謹度太高,處理方法:改用低嚴謹度裂解液。

  23. 進行IP反應時,抗體、磁珠的加樣和反應順序會對最終結果有影響嗎?
  24. 答:一般有三種反應順序:1.樣本+抗體先反應,然后加磁珠;2.抗體+磁珠先反應,然后放入樣本中;3.樣本+抗體+磁珠同時反應。推薦使用第一種和第二種,差別不大。不推薦用第三種,第三種方式雖然可以減少反應時間,但有實驗表明同時加入三個組分的方式會使最終的結果變差。

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