人源化抗體構建原則與實驗案例

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chimeric-monoclonal-antibody第一代人源化抗體是將鼠McAb的可變區和人抗體的恒定區組成嵌合抗體。由于這兩部分在空間結構上相對獨立,其獨特的抗原親和力保持得很好,但因為有鼠McAb可變區的存在,應用時仍有強烈的HAMA反應。
在此基礎上,進一步將鼠McAb可變區中相對保守的骨架區(Framework region, FR)換成人的FR,僅僅保留抗原結合部位的互補決定區(Complementarity-determining region, CDR),這才是真正意義上的抗體人源化。但起腳手架作用的FR不僅提供了CDR的空間構象環境,有時還參加抗體結合位點正確構象的形成,甚至參加與抗原的結合。因此,簡單的CDR移植往往喪失或降低了原抗體的親和力。如何在FR中、FR和CDR之間進行操作,目前有四種策略。

人源化抗體構建原則與策略

1.模板替換

使用與鼠對應部分有較大同源性的人抗體FR替換鼠FR,在選擇人FR時一般有兩條途徑。
第一種是對鼠McAb采用同一個(或少數幾個)人源FR進行替換。已有晶體結構數據的人源抗體的可變區框架(VH如NEW,KOL,VL如REI等)用作替換的基本模板,借助序列比較與分子模建確定在人、鼠間有種源差異,尤其是鼠FR中與互補決定區CDR有密切作用的氨基酸殘基,保留在替換的人源FR中。為了保持CDR的空間構象,要特別注意原來抗體的CDR下面的堆積殘基,以及CDR周圍的殘基。
該途徑的優點在于,確切的人源FR晶體結構為殘基替換提供了較明確的信息;不足在于不易保持鼠CDR的天然構象,很可能降低或喪失抗體的親和力。
第二條途徑是,在已有的抗體序列庫中搜尋與鼠McAb FR有最大同源性的人源FR用以替換。在選擇同源的人FR時,先前的工作者倡導將VL和VH作為一個整體來考慮,尋找最高同源的人FR。其理由是同一個抗體的VL和VH在折疊上更能匹配。以后的工作者則認為,將VL和VH分開考慮,分別尋找最高同源的對應序列,更好地保持FR原來的框架,在整體上給鼠CDR提供最類似的環境。總之,同源替換主要考慮的是,鼠CDR在此背景下有類似的折疊環境,從而可保持原來的構象。同樣需要分子模建來提供CDR移植后可能或缺的FR關鍵殘基的信息。同源替換的優點是,能減少需要更改的氨基酸數目,更好地保持CDR需要的空間環境;不足的是選擇的人源FR可能并無結構數據,不能提供有效的關鍵殘基信息。

2.表面重塑

對鼠CDR及FR表面殘基進行鑲飾(veneering)或重塑(resurfacing),以使之類似于人抗體CDR的輪廓(profile)或人FR的型式(pattern)。
表面重塑途徑的一個前提是,鼠McAb可變區的免疫原性起源于它的表面殘基。因為殘基的運動性和溶液可及性是其成為抗原決定簇的基本條件,因此表面殘基理應攜帶全部或絕大部分的抗原表位。溶液可及性表面殘基的劃分標準是—構成該殘基的全部原子的30%以上是溶劑可及的。盡管人、鼠間抗體可變區表面暴露殘基的精確型式有差別,但大多數的表面位置的殘基類別有強烈的傾向性,僅僅考慮這種表面型式就可分出抗體可變區的組別。這說明抗體可變區表面至少也和框架區核心一樣保守,表面型式的差別是人鼠間抗體的主要差別。根據對現有的抗體晶體結構數據的分析結果統計,在序列配對位置上,人、鼠間抗體可變區殘基的相對溶劑可及性分布的保真度達98%。這說明在異種間誘導免疫反應的殘基是由其余的種特異性溶液可及表面殘基引起的。將鼠特異性表面殘基換成人源性的,就可模擬人源抗體的表面輪廓,逃避人體免疫系統的識別,達到人源化的目的。該策略可以不進行同源模建,在序列同源分析的基礎上,選擇與鼠表面殘基暴露類型最相匹配的人源型式進行,但不夠準確。另外,如果要改變的殘基在側鏈大小、電荷、疏水性,或有可能形成氫鍵從而影響到CDR的構象,則不予改變。因為要改變的殘基較少,能減少CDR-FR之間的不相容性。
該策略作為較新的一種人源化途徑,還在逐步成熟階段。鼠源McAb在人體引起的HAMA反應,究竟是完全由其表面的暴露殘基引起,還是由表面殘基與內部殘基的共同貢獻,涉及到抗體產生最基本的免疫學機制,而這種機制仍是目前探討的熱點。

3.補償變換

在人FR選擇與CDR有相互作用、與抗體的親和力有密切關系或對FR空間結構折疊起關鍵作用的殘基進行改變,以補償完全的CDR移植。
立體結構數據和同源性分析表明:在抗原結合、穩定CDR構象、FR折疊(內部堆積)這幾個方面而言,構成抗體FR的殘基并不具有相同的重要性。以此為依據將這些殘基分成3類:低風險性(low-risk)殘基,即暴露于溶劑而對抗原結合和抗體結構貢獻甚少的殘基。替代這些位置的殘基能降低免疫原性而幾乎不影響抗體的親和力;高風險性(high-risk)殘基,即直接參與抗原結合、穩定CDR構象或FR折疊的殘基。為了保持人源化抗體的活性,應盡量避免在這些位置進行替換。對中度風險性(moderate-risk)殘基應謹慎從事。FR中的高風險性殘基和某些中度風險性殘基,通稱為非CDR區補充調控殘基(non-CDR complementarity modulating residues)。它們散布于線性序列的不同位置,為每個CDR回折(loop)提供了合適的”平臺”。其形狀和側鏈大小協同決定CDR的基本構象,并影響其抗原結合的特異性。因而將CDR搬到人源FR后,必須將人FR中的這些位置替換成鼠源非CDR區補充調控殘基以補償完全的CDR移植。
這種分析方法使人源化突變方案具有選擇性和針對性,避免了盲目的可能導致失敗的探索。通過在中度風險性殘基中進行變化,還有可能提高人源化抗體的親和力。不足的是對殘基的分類要以晶體數據和三維結構為基礎,才能提供準確的標準。

4.定位保留(positional consensus method)

人源化McAb保留了鼠源McAb可變區中參與抗原結合的氨基酸殘基,包括CDR和FR中的一些關鍵殘基。盡管鼠框架區的其余部分可以從某個人FR中搬移過來,毫無疑問,這樣得到的人源化抗體序列和人抗體的保守序列(consensus sequences)在一些位置上有差別。這些來源于個體型抗體親和力成熟過程中體細胞突變的非典型殘基,應用于病人后會誘導免疫反應。因此,理想的途徑是,以人FR保守序列為模板進行人源化。由于人抗體輕、重鏈可變區不同亞類的保守序列并不相同,需要一種合適的方法來尋找最適保守序列。最簡位置模板(minimal positional template)表明,抗體可變區中哪些位置絕對需要保持抗體的抗原結合結構域的完整性,提供了確定關鍵位置的方法。
在選擇人框架區時,首先從現有的人源抗體保守序列中搜尋與鼠框架區最類似的序列;其次根據最簡位置模板確定鼠可變區的關鍵位置殘基;最后保留所有這些位置而將其余部分進行人源化。
以上所述人源化的四種策略均以保持抗體的親和力為核心,以降低免疫原性為目標,各有特點。總之,抗體人源化設計的關鍵步驟是:

  • 從同源抗體中或共同序列抗體中選擇人源FR。
  • 根據已發表的信息,確定FR中起關鍵作用的氨基酸。
  • 以鼠McAb可變區立體模型作指導。

在設計過程中,同源分析和分子模建提供了必需的輔助手段。雖有一些一般性原則,但對某一具體的鼠McAb進行人源化時則必須具體分析。

實驗案列—人鼠嵌合抗體重鏈基因轉染小鼠骨髓瘤細胞

本文介紹了通過人鼠嵌合抗體重鏈基因轉染小鼠骨髓瘤J558L的研究,較詳盡地闡述了用原生質體融合法將重組的人鼠嵌合抗體重鏈基因轉染到J558L骨髓瘤細胞中,并用ELISA法檢測轉染子的過程和方法。

實驗材料

細胞株:骨髓瘤細胞株J558L,本身能合成免疫球蛋白λ輕鏈多肽, 但不分泌到細胞外。
供體菌株:E.coli HB101,帶有含人鼠嵌合抗體重鏈基因的pSV2ΔHgptS107VHHuG4質粒。
細胞長生培養基:IMDM + 1%慶大霉素 + 1%制霉菌素 + 10%小牛血清。
H×M:選擇培養基 + 次黃嘌呤(0.45ug/ml) + 黃嘌呤0.03mg/ml + 霉酚酸(0.6mg/ml)。
羊抗人IgG:辣根過氧化物酶標的綿羊抗人IgG。
溶菌酶溶液:5mg/ml溶在250mmol/L Tris溶液(PH 8.0)。
PEG-DMSO:47.1% PEG1500-12.5% DMSO-100mmol/L Tris,用DME配制。

實驗方法

  • 細菌的培養:接種E.coli HB101(含質粒)于LB液體培養基中, 含50ug/ml的氨基芐青霉素,37℃ 振蕩培養過夜。第二天以1010接種量接于100ml LB培養基中,37℃振蕩培養至OD 600達到0.5,加人氯霉素至終濃度125ug/ml,培養12h,擴增。
  • 原生質體的制備:取上述培養的細菌,加到滅菌的離心管中,4000×g離心15分鐘,取沉淀,按每個OD600加10ml蔗糖一溶菌酶溶液使其終濃度分別為2%和0.5mg/ml,輕輕搖動,置冰上5分鐘,加入2ml冷的250mmol/L EDTA(PH8.0)輕輕旋動,37℃,保持8分鐘30秒。然后分四次加入40ml的10%超純蔗糖-10mmol/L MgCl2-DME(5ml,5ml,10ml,20ml)室溫放置30分鐘, 備用。
  • 原生質體與骨髓瘤細胞的融合:取生長狀態良好的骨髓瘤J558L細胞懸液5ml,2000×g水平離心7分鐘,吸掉培養基,用DME洗一次。加入5ml上述的細菌原生質體懸液,懸浮細胞沉淀物,混勻,2000×g室溫下離心,7分鐘,棄去上清。彈松沉淀、加人0.5ml PEG-DMSO液,室溫振蕩1分鐘,加入0.5ml 25% PEG-100mmol/L Tris,搖動2分鐘。然后加入預先保溫的DEM 10ml,稀釋細胞懸液,2000×g室溫離心6分鐘,棄去上清液,向沉淀中滴加12ml細胞的生長培養液。混勻后在96孔培養板的每孔中加2滴,于CO2培養箱中37℃培養。
  • 轉染子的篩選:經上述轉染的細胞在37℃培養2天后,在每孔,2滴選擇培養基,又經過4天后,吸出一半培養基,補加新鮮的選擇培養基。其后,不定期地用選擇培養基換液。
    抗體的檢測:經上述轉染的細胞在37℃培養后,檢測抗體。采用ELISA法檢測轉染子所表達的嵌合抗體。

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