細胞轉染方法比較

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摘要:對哺乳動物細胞轉染表達蛋白來說,選擇合適的轉染方法和轉染試劑對轉染的成功率起到決定性作用。本文主要列舉了瞬時轉染和穩定轉染的一些方法、原理及適用性,并列舉脂質體細胞轉染的步驟、注意事項。

細胞轉染,是指將外源基因導入細胞內的一種技術。根據哺乳動物細胞蛋白表達流程,細胞培養完成后需進行細胞轉染,根據不同的實驗目的選擇不同的轉染方法。目前,常用的細胞轉染方法主要分為三類途徑:物理介導(電穿孔法,基因槍法、顯微注射法)、化學介導(脂質體轉染法、磷酸鈣共沉淀法、陽離子聚合物介導法)、生物介導(病毒介導轉染、原生質體轉染)。

理想細胞轉染方法,應該具有轉染效率高、細胞毒性小等優點。目前實驗室常用的轉染方法有脂質體轉染,陽離子聚合物轉染和病毒轉染,不同的轉染方法各有利弊,針對細胞的習性和不同的實驗目的選擇相對合適的轉染方法。下面列舉了一些常用轉染方法的原理,優缺點和適用性:

細胞轉染方法比較

細胞轉染方法 細胞轉染原理 主要特點
陽離子脂質體轉染法 帶正電荷的脂質體靠靜電作用和DNA結合形成DNA-脂質體復合物,然后通過細胞的內吞作用進入細胞 a)操作簡便
b)適用于各種裸露的DNA和RNA片段
c)適合轉染各種的細胞
d)對DNA濃度有一定要求
e)對細胞有一定的毒性
瞬時轉染
穩定轉染
所有細胞
陽離子聚合物 帶正電的陽離子聚合物與核酸的磷酸基團形成帶正電的復合物,復合物和帶負電的細胞膜接觸,并通過內吞作用進入細胞 與脂質體轉染法類似,但是具有很低的毒性,操作簡單,適用性廣,是新一代轉染試劑 瞬時轉染
穩定轉染
所有細胞
磷酸鈣法 磷酸鈣能夠促進外源DNA和細胞的結合,磷酸鈣-DNA復合物能夠附著到細胞表面,并通過內吞作用進入細胞 a)操作簡單
b)對DNA濃度要求高
c)適用性有局限(不適用于原代細胞)
瞬時轉染
穩定轉染
電穿孔法 高脈沖的電壓破壞細胞膜,在細胞膜表面形成孔道,DNA通過孔道進入細胞 a)適用性廣,適用于質粒和幾十kb的基因組片段
b)針對不同細胞要優化實驗條件
c)細胞致死率較高
瞬時轉染
穩定轉染
所有細胞
顯微注射法 利用顯微操作系統和顯微注射技術將DNA直接注入到細胞中 a)整合率較高,適用于工程改造和轉基因動物的建立
b)操作復雜,且需要昂貴精密的設備
c)外源基因的整合位點和拷貝數無法控制,會導致片段缺失、突變
瞬時轉染
穩定轉染
逆轉錄病毒轉染 通過病毒的膜蛋白和細胞表面的受體相互作用而進入細胞,利用宿主細胞酶自行轉錄復制合成DNA,并隨機整合到細胞基因組中 a)轉染效率高,適用于難轉染細胞轉染
b)利用病毒介導轉染,外源基因整合較穩定
c)逆轉錄病毒只選擇感染分裂細胞
d)容納外源基因長度<8kb
穩定轉染
特定細胞轉染

脂質體轉染步驟

  1. 細胞培養:細胞鋪板,加入一定量的細胞培養液,37℃二氧化碳培養箱中培養,待細胞密度生長至80-90%時,準備轉染。
  2. 在EP管中,加入無血清稀釋的轉染試劑,室溫放置5min
  3. 在EP管中,加入無血清培養基稀釋的DNA,室溫放置
  4. 5min,并將二三步得到的兩物質混合得到C液,輕輕混勻,室溫下放置15-30min。
  5. 用無血清培養基將細胞洗滌兩次,在細胞中加入適量的無血清培養基
  6. 將混合得到的C液緩緩加入到細胞中,搖勻,在37℃的二氧化碳培養箱中培養6-24小時。
  7. 細胞培養6-24小時后,吸去無血清轉染液,加入正常培養液繼續培養

注意事項:

  1. 轉染是不能使用含有血清的培養液,血清對轉染效率影響很大
  2. 轉染前鋪板時用無雙抗培養基,抗性的增加會影響轉染效率
  3. 鋪板24小時內進行轉染
  4. 整個操作過程輕柔,避免劇烈震蕩

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