細胞池篩選

在穩定細胞系構建實驗中,部分外源基因能夠通過細胞質進入細胞核內,下載并通過分子間重組,最終整合進宿主細胞染色體,不同外源基因整合位點不同,只有整合到表達區的基因才會表達。想要獲得穩定表達的細胞株,需要對轉染后得到的細胞池進行陽性克隆篩選。如果想要獲得穩定轉染的單克隆細胞株,還需要進行單克隆篩選。
本文主要對細胞池的篩選原理、篩選系統及單克隆細胞株的篩選策略做一介紹。

細胞池篩選

細胞池篩選系統可以分為非基因擴增選擇系統與基因擴增選擇系統兩種。G418是最常用的非基因擴增系統,基因擴增選擇系統DHFR系統及GS系統最為常用。

細胞池篩選原理

轉染宿主細胞的質粒帶有某種選擇性標記(例如代謝標記、抗生素標記等),將帶有標記的質粒轉入宿主細胞后,利用選擇性培養基進行篩選,未成功轉染質粒或轉染位點不合適的宿主細胞會因為缺乏選擇標記,無法在選擇培養基上生長而死亡,成功轉染的陽性克隆可以在選擇培養基上生長,從而達到篩選陽性克隆的目的。
在擴增選擇系統中,還會對轉染后的宿主細胞施加相應的選擇壓力,只有外源基因表達水平高的細胞株才可以存活,從而篩選得到高表達的穩定細胞株。

G418篩選系統

G418是一種氨基糖類抗生素,可通過干擾核糖體功能來阻止哺乳動物細胞蛋白質的合成,因此哺乳動物細胞無法在含有G418的培養基上生長。neo抗性基因對G418有抗性,可以將G418轉變為無毒形式,帶有neo基因的宿主細胞可以在G418培養基上生長。將帶有neo抗性基因(抗生素標記)的質粒轉入哺乳動物細胞,如果neo基因被整合進真核細胞基因組中合適的地方,則哺乳動物細胞會獲得抗性在含有G418的選擇培養基中正常生長,而沒有成功整合neo抗性基因的細胞則會死亡,從而達到篩選陽性克隆的目的。

DHFR篩選系統

DHFR篩選系統的宿主細胞為CHO-dhfr-細胞。由于缺少dhfr,無法合成核酸,宿主細胞無法在不含HT的選擇培養基中生長,當攜帶dhfr基因的表達質粒轉染CHO細胞后,轉染成功的陽性克隆可在選擇培養基中生長。dhfr可被葉酸類似物氨甲喋呤(Amethopterin,MTX)所抑制,不斷提高MTX濃度,絕大多數細胞死亡,但存在少數穩定轉染的細胞,dhfr基因擴增獲得抗性,從而生存下來。用帶有目的基因和dhfr標記的質粒轉染CHO-dhfr-細胞,再通過MTX加壓篩選,當dhfr基因進行擴增時,目的基因也會隨dhfr基因一起擴增,從而獲得高表達的細胞株。

GS篩選系統

GS系統(glutamine synthetase Gene Expression System)即谷氨酰胺合成酶基因表達系統,是新近發展的更有效率的擴增表達系統。谷氨酰胺合成酶能將谷氨酸和氨合成為谷氨酰胺,這種酶促反應是動物細胞獲得谷氨酰胺的途徑。
GS系統篩選原理
化學誘變獲得的GS缺陷型細胞株不能在不含谷氨酰胺的培養基中生長,除非它被含有GS表達原件的載體轉染后獲得了有活性的GS,通過向培養有GS重組細胞的培養基中添加濃度不斷提高的GS抑制劑L-氨基亞砜蛋氨酸(Methionine Sulphoximine ,MSX),這種選擇壓力可使細胞發生基因重排和擴增。通過多輪篩選,可獲得高表達的細胞株(細胞內的外源基因拷貝數可達1000~2000拷貝/細胞)。

單克隆細胞株篩選

根據下游應用的不同,單克隆細胞株可以分為兩類:用于研究的研究型單克隆細胞株以及用于蛋白/抗體大量生產的生產型高表達單克隆細胞株。

研究型單克隆細胞株篩選

研究型穩定細胞株通常利用G418系統進行陽性克隆篩選,neo基因為非擴增基因,它対基因的拷貝數沒有影響,利用G418對細胞池進行篩選可得到穩定轉染的陽性克隆,對得到的陽性克隆進行有限稀釋挑取單克隆即可得到研究型單克隆穩定細胞株(獲得單克隆后需進行穩定性測試測試穩轉株的穩定性)。
研究型單克隆細胞株篩選

圖1:研究型穩定細胞株構建流程

生產型單克隆細胞株篩選

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生產型穩定細胞株通常利用GS系統或DHFR系統進行陽性克隆篩選,dhfr與GS都具有基因擴增的功能,對其進行加壓會促使基因擴增,從而使目的基因共擴增而提高表達水平。外源基因在CHO細胞中擴增是提高表達水平的重要策略之一。
生產型細胞株篩選通常有以下幾種實驗方案:

  1. 從細胞池中挑取單克隆,然后對每個單克隆進行加壓擴大培養繼續篩選單克隆;
  2. 對細胞池進行加壓篩選,在多次加壓篩選后,最后一步進行克隆化;
  3. 先對細胞池進行加壓篩選,隨后挑取單克隆,最后針對每個單克隆進行加壓擴大培養繼續篩選。

生產型單克隆細胞株篩選

圖2:生產型穩定細胞株篩選流程(c方案)

三種實驗方案比較:通常來說b策略的表達水平比不上a,即混合克隆的表達水平遠趕不上表達較高的單個克隆,原因是轉染的CHO細胞中存在不表達或低表達的非生產細胞,并可長期生存,甚至加壓篩選時占生長優勢,排斥其它高表達細胞,成為細胞群體中的主要部分,導致產量嚴重下降;a方案與b方案相比耗費更多的人力及時間,通常穩轉細胞株的實驗周期為3個多月,而采用方案a,至少需要4個月甚至更多;c方案綜合了方案a與b的優點,是目前推薦的實驗方案。

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