細胞生長曲線繪制-MTT法

摘要:通過MTT法可以得到細胞的生長曲線,也可對瞬時轉染后的細胞進行檢測,本文主要介紹了MTT的作用原理及實驗操作要點。

下載

MTT全稱3-(4,5-二甲基噻唑-2)-2,5-二苯基四氮唑溴鹽,商品名為:噻唑藍。是一種黃顏色的染料。MTT主要有兩個作用:① 藥物(或其他處理方式如放射線照射)對體外培養的細胞毒性的測定(如細胞瞬時轉染表達后可對細胞進行MTT檢測)② 用于細胞增殖及細胞活性的測定,可以制得細胞生長曲線。

MTT法檢測細胞存活和生長的主要機理是:活細胞中的某些物質(線粒體中的琥珀酸脫氫酶)能夠和MTT反應,使MTT還原為水不溶性的藍紫色結晶甲瓚(圖1)并沉積在細胞中,而死細胞沒有此功能。DMSO(二甲基亞砜)能夠將此結晶(藍紫色甲瓚)溶解,在酶聯免疫檢測儀490nm波長處測定其吸光值,能夠間接的反應活細胞的數量。一定范圍內,藍紫色結晶沉淀的數量與細胞數成正比。目前MTT法因其靈敏度高,經濟快速等優勢被廣泛的運用于細胞毒性試驗,腫瘤藥物的篩選、放射敏感性測定和對某些生物活性因子的活性檢測等方面。MTT法也有自身的缺點,如MTT檢測生產的藍紫色產物(甲瓚)不溶于水,需被溶解后才能檢測。一方面使得工作量增加,另一方面對實驗結果的準確性產生一定的影響,且用于溶解甲瓚的有機溶劑對人體有一定的危害。細胞瞬時轉染表達后的細胞也可做MTT實驗,多數人不知道是先轉染再做 MTT,還是先做MTT再進行瞬時轉染,這里建議是先做轉染,培養一段時間后(24/48h),重新接種至96孔板,加藥兩天左右,再進行MTT檢測。

MTT法繪制生長曲線

水不溶性的藍紫色甲瓚

實驗準備

  1. 儀器:酶聯免疫檢測儀,血球計數板,96孔板,離心管等
  2. 試劑:MTT溶液,胰蛋白酶,DMSO(二甲基亞砜),血清培養基
  3. MTT 溶液的配制
    用PBS緩沖液溶解MTT粉末。PBS( ph=7.4)配置:Nacl (8g)+ Kcl( 0.2g)+Na2HPO4 (1.44g)+KH2PO4 (0.24g)調pH 7.4,定容至1L。
    此處MTT 的濃度為:5mg/ml。稱取 0.5克MTT粉末,溶于100 ml的磷酸緩沖液(PBS)中,用0.22μm濾膜過濾除去溶液里的細菌。在配制和保存的過程中,最好避光。如在超凈臺中配置該溶液,可將日關燈關掉操作,同時容器用鋁箔紙包住(避光),4℃ 避光保存即可。使用勿超過兩周,一旦MTT變色,即刻停止使用。建議是MTT最好現用現配,分裝一定量的MTT粉末在EP管中,用的時候現配直接加到細胞培養板中操作方便也避免浪費。
    此外,MTT具有致癌性,無論是配置還是實驗都要注意做好防護準備。MTT對菌敏感,配置或保存的時候要保證無菌,且要避光。

在進行實驗時,由于實驗作用時間較短,因此可不避光,但是要將超凈臺的日光燈關掉,效果會更好。

實驗操作

  1. 常規消化細胞,離心收集細胞沉淀,用血清培養基懸浮細胞,制成單細胞懸液,并用進行細胞計數
  2. 接種細胞:稀釋細胞濃度至1×104 /ml。吸取200ul的細胞懸液加入到96孔板中(注意設置空白對照組)
  3. 對于瞬時轉染的細胞,轉染后24h消化細胞,重新接種至96孔板,培養18h加藥兩天后進行MTT檢測
  4. 細胞培養:常規培養細胞,每兩天換一次液
  5. 呈色:從細胞培養第二天開始,即可每天按照固定時間取出96孔板并加入MTT溶液20ul,37℃培養4h后,將孔中上清小心的吸去,加入150ul的DMSO,震蕩10min,使沉淀充分溶解
  6. 在酶聯免疫檢測儀上設置490nm波長測定吸光值,進行檢測并記錄結果(取平均值)
  7. 每天取出96孔板重復操作,并記錄結果
  8. 以時間為橫坐標,吸光值為縱坐標繪制細胞生長曲線

結果分析

繪制結果應當如圖2所示,呈現S形。與細胞培養計數法獲得的生長曲線接近。前三天左右為停滯期,隨后細胞進入對數生長期,最后進入穩定生長時期。

因為在相同體積內細胞數與吸光度成正比,所以在對數生長時期,曲線越傾斜(斜率越大),細胞的群體倍增時間越短。

TMM法生長曲線繪制實驗結果

圖2 MTT法實驗結果

操作要點

  • 實驗設置空白對照組,步驟保持一致,一組只加培養基不加細胞,比色以空白調零
  • MTT實驗吸光度最后在0-0.7之間,超出這個范圍則不是直線關系
  • 加DMSO之前要盡量去掉培養液,便于DMSO溶解甲瓚顆粒進行比色測定
  • 實驗中使用各培養基的量,按照說明書操作(根據經驗適時調整)
  • 每孔細胞濃度維持在20個/ul,加20ul MTT,作用四小時后洗掉上清液。注意不要將甲瓚洗掉,然后每孔加150ul DMSO,振蕩10分鐘,然后測吸光值
  • 細胞瞬轉MTT檢測,轉染6h,24h或48h消化細胞進行重新接種,此時間根據細胞生長狀態決定,一般在加藥2天后進行MTT檢測

利用細胞計數法也可以繪制生長曲線,具體的實驗操作及結果分析方法請查看:細胞計數法繪制生長曲線

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