細胞生長曲線繪制-細胞計數法

摘要:細胞生長曲線的繪制方法多種,本文主要介紹通過細胞計數法繪制生長曲線,下載幫助我們更好的了解細胞的生長狀態及活力,從而指導下游實驗操作。

細胞計數法繪制生長曲線,是細胞培養研究中常用的技術手段。原理就是通過測定單位體積內的細胞數量,得到細胞的總濃度進而計算出細胞總數。

典型的細胞生長曲線分為四個時期:延滯期,指數期,穩定期和衰亡期。不同時期的細胞生長狀態和性能各不相同。通過測定生長曲線,可以測定細胞絕對生長數,判斷細胞活力,可用于測定藥物等外來因素對細胞生長的影響,有助于我們選擇該時期的細胞進行細胞下游實驗(瞬時轉染或穩定轉染)。以下介紹細胞計數的主要方法和注意點:

實驗準備

  1. 儀器:二氧化碳培養箱,顯微鏡,超凈工作臺,血球計數板
  2. 試劑:胰蛋白酶,培養基(血清)

實驗操作

  1. 取生長良好的細胞,用胰蛋白酶消化,離心
  2. 離心后去上清,加入新鮮適量的培養基重懸細胞,使之成為單細胞懸液
  3. 按照一定的倍數稀釋該單細胞懸液,稀釋倍數以稀釋結果細胞數在20-200之間為合適倍數
  4. 準備血球計數板,洗凈晾干
  5. 吸取一定量的細胞懸液,加樣到血球計數板上,顯微鏡下計數
  6. 按照血球計數板的計數原理進行細胞計數
  7. 計算細胞總數, 調整細胞至一定濃度(1×105/ml)。細胞濃度=細胞計數板得到的細胞數量/4x稀釋倍數x104/ml
  8. 細胞再培養,準備24孔板,每孔中加入0.1ml的細胞(即1×104個細胞)和0.9ml的細胞培養基,輕輕晃動孔板(十字方向晃動),使細胞分布均勻,并進行常規細胞培養(48h后換液培養)
  9. 培養48h后,即可每過24h取樣一次,每次取樣至少取3個孔的細胞,多次計數取平均值,提高準確性),取樣細胞常規胰蛋白酶消化,制備單細胞懸液,顯微鏡下進行細胞計數
  10. 計數結果,以時間(d)為橫坐標,細胞數為縱坐標,繪制細胞生長曲線

結果分析

根據培養的時間和細胞計數的結果得到如下圖,細胞培養初始幾天生長緩慢,為延滯期。兩到三天之后細胞進入對數生長期,此時細胞生長最為旺盛,細胞活力也相對最佳,通常在我們的細胞轉染或構建穩定細胞系時選擇對數生長期的細胞。一段時間后細胞進入穩定生長時期

細胞生長曲線一

操作要點

  • 細胞用胰蛋白酶消化,消化時間要自己把握,時間短細胞消化不好形成團狀,時間長細胞死亡率可能會增加,制備成單細胞懸液即可
  • 細胞計數時,按照計數原理數細胞,每個大方格中的細胞大于200小于20,則稀釋倍數不適,需重新稀釋。在消化細胞計數之前,可自己估算培養瓶中的總細胞數,這樣可以預估下稀釋的倍數,避免重新稀釋
  • 細胞接種時細胞搖均勻,接種按照十字方向晃動,晃動時間可以延長,以避免形成細胞團為準,但要防止細胞液濺出
  • 細胞培養易被污染,污染原因也多種多樣,實驗室環境,細胞自身原因,如果為菌類污染建議丟棄重新復蘇培養,更多相關情況及解決可參考資料專區細胞培養FAQ

細胞計數法繪制生長曲線,操作相對簡便。此外,MTT比色實驗也能檢測細胞的存活和生長,得到細胞生長曲線,且靈敏度高,重復性好,具體原理和操作見MTT法繪制生長曲線

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