哺乳動物細胞傳代培養

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隨著細胞基因工程的不斷發展,目前有多種生物表達系統都能夠大規模的生產重組蛋白,主要分為原核和真核兩類。真核表達系統又包括:酵母表達系統,哺乳動物細胞表達系統,昆蟲桿狀病毒表達系統。相比之下,哺乳動物細胞表達系統最突出的優點是能夠促進蛋白的正確折疊和糖基化等翻譯后修飾,從而保證蛋白的天然活性,目前已成為表達和生產部分蛋白藥物、基因工程抗體等目的蛋白的首選宿主。

哺乳動物蛋白表達常用的細胞有HEK293(人胚腎細胞)和CHO(中國倉鼠卵巢細胞)。這兩種細胞的應用最為廣泛,是在真核蛋白表達系統中最常用的細胞,具有以下特點:

  1. 具有準確的轉錄后修飾功能,表達蛋白在任何方面都最接近天然狀態;
  2. 具有重組基因的高效擴增和表達能力,外源蛋白整合穩定;
  3. 具有較高的耐受剪切力和滲透壓能力,表達水平較高;
  4. CHO屬于成纖維細胞,是一種非分泌細胞,自身很少分泌內源蛋白,有利于目的蛋白的分離純化;
  5. HEK293細胞具有更高的生長密度更快的生長速度,易培養,易轉染。

本文主要對HEK293細胞及CHO細胞傳代培養的基本原則、實驗步驟及注意事項進行介紹。

細胞培養基本原則

合適的細胞培養基

合適的細胞培養基是細胞傳代培養最重要的條件,培養基不僅提供給細胞在體外生長繁殖需要的基礎物質,還維持細胞生長的整個環境,不同的細胞有不同的生長習性,因此要選擇合適的培養基。

優質血清

目前,多數的合成細胞培養基都有添加血清,常用的血清有小牛血清、馬血清等。血清中含有細胞生長所必須的生長因子,作為哺乳動物細胞培養的附加物,血清十分昂貴且存在多種問題,因此人們在不斷尋找可以替代血清的物質。

無毒無菌的生長環境

體外生長的細胞缺乏對微生物和有毒物質的抵御能力,一旦被污染,會導致細胞死亡。因此在進行細胞傳代培養時,無毒無菌的培養環境是必要條件。

溫度與氣體環境

細胞生長需要恒定的溫度,同時氣體(氧氣與二氧化碳)也是哺乳動物細胞培養的所必須的物質,HEK293和CHO的細胞培養條件一般是37℃,5%的二氧化碳環境。

細胞傳代實驗流程

細胞復蘇

  1. 提前將水浴鍋打開,預熱37℃。
  2. 細胞培養基提前預熱,5-10ml于15ml離心管中。
  3. 把凍存細胞立即投入37℃水浴鍋中,輕微搖動,待融化后(大概1-1.5min),取出。
  4. 用75%乙醇消毒管外壁,放入超凈臺,轉移到含5-10ml培養基的15ml離心管中,離心800-1000rpm,5min。
  5. 去掉上清,加入完全培養基重懸細胞,轉移到培養皿中,前后左右輕輕搖動,使培養皿中的細胞分散均勻。
  6. 標記好細胞名稱,代數,日期,培養基等,放到37℃的5% CO2培養箱中培養。
  7. 貼壁細胞培養一般第二天就可以貼壁,根據細胞生長速度,2-3天換一次培養基。
  8. 離心可能對某些細胞造成傷害,這些細胞可以不離心,只需要將DMSO的濃度降到1%以下即可。(一般凍存液中DMSO濃度為10%,即1ml凍存細胞需加9ml培養基。)

細胞傳代培養

  1. 當培養皿中的細胞覆蓋率達到80%-90%時需要進行細胞傳代。
  2. 吸掉培養皿中的舊培養液。
  3. 用5ml PBS洗滌細胞1-2次。
  4. 用1ml的trypsin(胰酶)溶液,37℃作用數分鐘,于倒立顯微鏡下觀察,當細胞呈圓形即將分離時,吸掉trypsin溶液。(若不去掉trypsin溶液,則在消化后加入適量(5:1)含血清培養基終止作用,離心后再去掉上清。)
  5. 輕拍培養皿或培養瓶使細胞從瓶壁脫落,加入適量的新鮮完全培養基,輕柔地吹打數次,使細胞分散均勻。再根據稀釋比例轉移至新的培養瓶中,正常培養即可,剩余細胞懸液舍棄,放入收集瓶中。(細胞傳代時按1:5或更大比例稀釋)
  6. trypsin溶液中可以加入0.02% EDTA溶液,解離效果會更好,但消化后殘留在培養基中的EDTA 會影響細胞的再次貼壁。

細胞凍存

  1. 冷凍前確保細胞處于指數生長期,傳代后的5mL細胞懸液取出1mL接種到培養瓶繼續傳代。另取一無菌離心管,將剩余4mL細胞懸液置于其中,離心1000rpm,5min(轉速勿超過1500rpm)。
  2. 離心后倒掉上層清液,收集下層細胞沉淀。向離心管中加入900ul完全培養基,用槍頭反復吹打重懸起細胞。取少量細胞懸液計數細胞濃度及凍前存活率。一般細胞濃度為2~5×106cells/mL較適宜。
  3. 將細胞懸液轉入1.5mL無菌凍存管中,再加入100ul試劑級DMSO,混勻,制成細胞凍存懸液(DMSO最后濃度為10%)。嚴密封口后,注明細胞名稱、代數、日期,然后進行凍存。
  4. 傳統方法:冷存管置于4℃ 10分鐘→-20℃ 30分鐘→-80℃ 16~18小時(隔夜)→液氮罐長期儲存(-20℃勿超過1小時,防止胞內冰晶過大造成細胞死亡)。

細胞培養注意事項

  • 細胞培養大瓶好于小瓶,細胞能夠充分汲取到養分且有利于細胞均勻分布
  • 細胞培養基DEME為高糖培養基
  • 保證細胞培養液新鮮,采用少量多次配置,或培養基保存于-20℃
  • 控制胰蛋白酶消化時間,消化時間長,細胞貼壁效果差
  • 控制好細胞傳代時間,細胞沒有完全鋪滿、細胞之間留有空隙時傳代最佳
  • 細胞凍存和復蘇的原則是慢凍快復,最大程度的保證細胞復蘇成功率

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