細胞培養常見問題分析解決

細胞的傳代培養    穩轉細胞株的構建

摘要:抗體的生產可通過不同的方式,哺乳動物細胞生產或刺激動物免疫系統生產,本文主要了介紹兩者的生產方式和區別。
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細胞污染

凡是對細胞生長有危害的成分或者造成細胞不純的異物都視為污染。細胞污染根據污染源可以分為化學污染,物理污染和生物污染。

化學污染

細胞培養所用到的培養基,水要高壓蒸汽鍋滅菌。其中,血清作為細胞培養中常用的培養基,血清存在潛在的化學污染,此外血清成分具有不確定性,血清對不同細胞的生長影響包括毒副作用等存在差異。

物理污染

物理污染,主要指溫度、振動、放射線、輻射等物理因素對細胞的破壞。如將細胞液培養基等暴露于放射線或紫外線下,會引起細胞代謝改變。恒溫培養箱的周圍存在能夠產生機械振動的設備,可能也會對細胞生長存在一定影響。

微生物污染

1.細菌:細菌污染常見的有大腸桿菌,葡萄球菌等。細菌污染較易發現,在普通倒置顯微鏡下為黑色細沙狀,培養液一般會在短時間內變黃,有時靜置的培養液不混,稍加震蕩,變會有很多混濁物漂起。顯微鏡下可見培養液中有大量圓球狀顆粒物漂浮,有時在細胞表面及周圍有大量細菌存在,細胞停止生長并有中毒表現。

處理:

  • 在培養液中加入相應的抗生素,能夠預防絕大多數的細菌污染
  • 保證器皿、水充分滅菌,空氣無菌,同時保證滅菌壓力。

2、霉菌:霉菌的污染多數是白色念珠菌, 曲霉菌,酵母菌等。霉菌污染后培養液短期內依舊清亮不變渾濁,倒置顯微鏡下可看見細胞之間有交錯的絲狀,樹枝狀菌絲,漂浮在培養液中。念珠菌呈卵圓狀,在細胞周邊生長。細胞被霉菌污染后,仍可生長,長時間細胞的活力狀態會變差。

倒置顯微鏡下的霉菌形態,呈現樹枝狀
念珠菌污染的形態(低倍鏡)

處理:先確定污染物的種類:細菌、真菌還是支原體。如果是霉菌污染。迅速將污染細胞與正常細胞系隔離,并對實驗中所用過的所有器皿工具消毒

3、支原體:支原體的大小介于細菌和病毒之間,是一種獨立生活的微生物。對熱敏感,對一般抗生素不敏感。支原體的形態多變,多吸附在細胞表面和細胞之間。電鏡下觀察,中心有高密度的密集顆粒,橫斷面與細胞微絨毛相似。

因國內的血清很多數都沒有做支原體陰性檢測,而支原體又是牛血清中最常見的微生物之一。支原體污染細胞后,培養液輕微發生混濁.但細胞變化不顯著,在細胞逐漸的培養中,細胞會慢慢死亡。

支原體污染檢測:

熒光染色法:DNA和與DNA特異性結合的熒光染料結合,使得支原體的DNA著色,然后用熒光顯微鏡觀察。鏡下支原體為散在于細胞同圍或附于細胞膜表面的亮綠色小點。

支原體熒光檢測

解決:

1.抗生素排除法:支原體污染預防比解決好。如果不小心污染后,可加入高濃度抗生素(常規使用的5倍濃度)作用24-48小時,再換入常規培養液,但該法不保證有效。推薦用量:慶大霉素 200ug/ml ,四環素10ug/ml ,卡那霉素50ug/ml 。

2.加溫除菌:支原體不耐熱,可以對支原體污染的細胞熱處理除菌。將支原體污染的細胞放置41度中作用10小時可殺死支原體。因高溫對細胞本身也會產生一定影響,故熱處理前需先進行預實驗,確定對細胞影響最小而能最大程度的殺死支原體的時間。

4、黑蛟蟲:黑膠蟲污染后細胞中出現小黑點,高倍鏡下可看見不規則的運動。培養液渾濁不明顯,對細胞生長狀態無太大影響。

解決:如果細胞出現黑膠蟲污染,可增加細胞的接種密度,提高細胞存活率。當細胞生長狀態很好時,黑膠蟲的數量會降低。細胞培養過程中堅持要每天換液,并用緩沖液沖洗,能夠大大降低黑膠蟲的數量,可最終消失,偶爾在鏡下可見個別小黑點,但整體細胞培養和后續的細胞轉染無影響。

細胞培養箱染菌清洗方法

用硫酸銅溶液擦拭CO2孵箱內,再把水盤里也加上飽和量的硫酸銅。或者在培養箱的托盤加入飽和的消毒磷酸氫二鈉高鹽液體,可以防止霉菌污染。

CO2孵箱被霉菌污染后,可把所有細胞暫時轉移,采用過氧乙酸擦洗孵箱(包括隔板,箱壁)。并把過氧乙酸放置在孵箱內一個小時,使其蒸汽彌漫。待過氧乙酸的氣味消散后,再移入細胞。孵箱應定期清潔(2月左右)。

其它培養箱清洗方法是:用84液擦洗-清水擦洗-75%酒精擦洗-紫外燈照。

預防霉菌污染,可在培養基里加3u/ml的兩性霉素或制霉菌素或放線菌素D或雙抗;但細胞一旦污染,制霉菌素或放線菌素D或雙抗都無法彌補,舍棄被污染細胞,并將環境徹底消毒。如果所有細胞都污染,可能是整體系統污染,檢查所有培養基和器材,并重新滅菌。針對個別污染,首先考慮操作問題,注意操作規范。

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