瞬時轉染和穩定轉染實驗流程

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瞬時轉染與穩定轉染是兩種常見的哺乳動物表達系統生產蛋白的方式,通過瞬時轉染能夠快速的實現微量至中量的重組蛋白的生產,通過穩定轉染(穩定細胞系構建)能夠實現長期、穩定的生產重組蛋白。本文主要對瞬時轉染與穩定轉染的實驗操作流程做一介紹。

瞬時表達實驗操作

目前有多種方式能夠實現細胞轉染,例如電穿孔法、基因槍法、脂質體轉染法、磷酸鈣轉染法、病毒轉染法等等。下面主要對脂質體轉染法的實驗操作進行介紹。

脂質體轉染

試劑配置

  • HBS(Hepes-buffered saline):876mg的氯化鈉溶于90ml左右的去離子水中,在加入1mol/L的Hepes,調整pH至7.4,定容至100ml,過濾。
  • 培養基:無血清的培養基,轉染正常細胞的培養基。

實驗流程

  1. 載體構建:這一步可交給基因合成公司進行,提供優化后的基因序列,克隆至相應的載體上;
  2. 細胞培養:轉染實驗開始前幾天開始進行細胞復蘇培養,至實驗當日細胞密度應達到60-80%;
  3. 細胞轉染:用無血清培養基洗滌細胞2次,每孔加入1ml的無血清培養基,隨后加入轉染試劑,按十字方向輕搖混勻,二氧化碳培養箱中37℃培養24小時
  4. 將轉染液倒出,換為完全培養基繼續培養,培養3-4天后檢測蛋白表達量

瞬時轉染實驗完整流程>>

  • 優化細胞轉染的條件,包括轉染質粒的純度(高純度),脂質體的用量及細胞的生長密度(可通過經驗論或實驗摸索),避免微生物的污染;
  • 脂質體混合物的制備,在脂質體轉染情況下,培養基采用無血清培養基;
  • 脂質體和DNA的加入保持一致,邊加入邊混勻,避免出現局部濃度過高;
  • 穩定轉染實驗操作

    • 質粒構建:目的基因構建至載體上,隨后對質粒進行線性化處理以便于目的只能夠順利轉染至染色體上。
    • 細胞轉染:與瞬時轉染的步驟相似。
    • 細胞池篩選:細胞轉染24-72小時后,去掉轉染液,進行抗生素篩選。

      1. 提前一天接種細胞于24孔板中,待第二天長成25%單層為宜,二氧化碳培養箱中37℃過夜培養;
      2. 第二天將培養液換成含抗生素的培養基,抗生素濃度按梯度遞增(0,50,100,200,400,800,1000ug/ml);
      3. 培養15天左右絕大多數細胞死亡抗生素濃度為準,一般為400-800ug/ml,篩選細胞時適當提高濃度;
      4. 二氧化碳培養箱中37℃培養72h后按照1:10的比例將轉染細胞傳代,使用預實驗(見下文)得到的抗生素濃度的培養基培養。
    • 有限稀釋法挑取單克隆:將細胞消化下來做連續的10倍稀釋,每稀釋一梯度都在96孔板中培養,生長一周左右再次挑取單克隆進行培養,如此反復3次;
    • Western blot或ELISA檢測蛋白的表達情況,挑取多個單克隆進行表達檢測,篩選出表達量最高的克隆傳代并保存。

    穩轉株篩選預實驗

    預實驗的目的是確定抗生素的最佳濃度,同時確定抗生素對所選細胞的最低作用濃度。具體實驗步驟如下:

    • G148的配置:取G418共1g溶于1mol/L的HEPES溶液1ml中,加蒸餾水至10ml,過濾除菌,4℃保存;
    • 細胞培養:取處于對數生長期的細胞(未轉染細胞,一般在鋪滿培養器皿底部的70%~80%時),用新鮮無抗生素無血清的培養基制成1×104個/ml 的細胞懸液。按等量接種入多孔培養板中,培養6h左右開始加藥;
    • 制備細胞培養基:在100~1000ug/ml范圍內確定幾個梯度,按梯度濃度用培養基稀釋G418制成培養基;
    • 加G418篩選:吸除培養基,PBS洗滌一次,每孔中加入不同濃度的培養基;
    • 換液:根據細胞活力和培養基的顏色,每三天(即每隔兩天)更換篩選培養基一次。如細胞生長過快,可以縮短換液時間(每隔一天)。有死細胞勤換液,可以減少對存活細胞的影響;
    • 建立死亡曲線,確定最佳篩選濃度:篩選10~14天后,可見有抗性的克隆出現,停藥用完全培養基培養。當有大量細胞死亡時,可以把 G418濃度減半維持篩選。

    細胞的穩定轉染>>

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